HPT-mCherry融合標(biāo)簽在水稻轉(zhuǎn)基因篩選鑒定中的應(yīng)用

陳娟 ，周潔 ，嚴(yán)成其 ，王栩鳴 ，楊勇 ，余初浪 ，程曄 ，陳劍平

1.浙江師范大學(xué) 生化學(xué)院，浙江 金華 321000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，農(nóng)業(yè)部植物保護(hù)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省植物病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)是利用生物學(xué)手段將目的基因?qū)胨净蚪M中的重要方法，主要用于水稻性狀的改良和基因功能的研究[1-2]。自1994年Hiei等建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化體系以來(lái)[3]，水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用和發(fā)展。水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)需要借助標(biāo)記基因來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子，實(shí)驗(yàn)中常用的標(biāo)記基因分為兩類(lèi)，即選擇基因和報(bào)告基因[4]。目前常用選擇基因?qū)D(zhuǎn)化的材料進(jìn)行較為高效的篩選，并利用其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)行輔助篩選。常用的選擇基因包括潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hygromycin phosphotransferase gene，HPT）[5]和抗除草劑基因（bi?alaphos resistance gene，bar）[6]等。使用潮霉素篩選抗性愈傷，可能篩選得到假陽(yáng)性的愈傷組織，往往需要借助PCR等方法檢測(cè)進(jìn)行輔助鑒定，而這些方法通常都比較耗時(shí)費(fèi)力。為了提高輔助篩選的效率，目前很多研究選用報(bào)告基因進(jìn)行輔助篩選。報(bào)告基因是一種編碼可被檢測(cè)的酶或蛋白質(zhì)的基因，例如β-葡萄糖苷酸酶基因（β-glucuronidase gene，gus）和熒光蛋白基因等[7-8]。gus通過(guò)編碼β-葡萄糖苷酸酶將底物水解為藍(lán)色產(chǎn)物，可進(jìn)行組織化學(xué)檢測(cè)，但檢測(cè)過(guò)程中需要破壞植物組織，限制了其在活體中的應(yīng)用[9]。相比gus基因，熒光蛋白基因的檢測(cè)較為簡(jiǎn)便，被廣泛使用。

雖然報(bào)告基因的輔助篩選是一種比較經(jīng)濟(jì)有效的方式，但還是存在一些無(wú)法避免的缺陷。最主要的缺陷就是報(bào)告基因需要額外的啟動(dòng)子和終止子來(lái)控制其表達(dá)。啟動(dòng)子和終止子是控制基因表達(dá)的重要元件[4]，而轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中常用啟動(dòng)子和終止子數(shù)量有限，重復(fù)使用相同的啟動(dòng)子或終止子，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)生遺傳重組，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)[4,10]。以植物轉(zhuǎn)基因中常用的CaMV（花椰菜花葉病毒）35S啟動(dòng)子為例，該啟動(dòng)子可以在植物體內(nèi)保持較高水平的表達(dá)，但該啟動(dòng)子內(nèi)含有一個(gè)重組熱點(diǎn)（TATA box），會(huì)使轉(zhuǎn)基因不穩(wěn)定，發(fā)生遺傳重組[11]。此外，使用多個(gè)啟動(dòng)子和終止子會(huì)占用多個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)，使得構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體時(shí)策略設(shè)計(jì)更為復(fù)雜。在本研究中，我們嘗試使用HPT-mCherry融合蛋白標(biāo)簽，利用HPT和mCherry篩選轉(zhuǎn)基因材料。mCherry是由DsRed突變得到的單體紅色熒光蛋白，在587 nm激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光，可以排除葉綠素的干擾[12-14]。利用潮霉素篩選陽(yáng)性愈傷，并使用熒光顯微鏡觀(guān)察愈傷組織和植株，操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確率較高，可以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

我們構(gòu)建了HPT-mCherry融合標(biāo)簽，用單一的融合蛋白同時(shí)實(shí)現(xiàn)篩選基因和報(bào)告基因的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HPT-mCherry融合標(biāo)簽?zāi)苡行У睾Y選陽(yáng)性愈傷，鑒定得到陽(yáng)性植株。

1 材料及方法

1.1 材料

日本晴水稻（Oryza sativa L.spp.japonica cv.Nipponbare）、根 瘤 農(nóng) 桿 菌（Agrobacterium tumefa?ciens）EHA105均為本實(shí)驗(yàn)室保存；TRIzol試劑（Invit?rogen公司）；iScriptcDNA合成試劑盒、SsoFast EvaGreen Supermix試劑盒、（Bio-Rad公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（Promega公司）；LightCycler 480定量PCR儀（Roche公司）；NanoVue紫外分光光度計(jì)（GE公司）；熒光體式顯微鏡（Leica公司）；燈式熒光檢測(cè)器（BLS公司，匈牙利）。

1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究中的相關(guān)載體骨架來(lái)自pCAMBIA1300（Canberra公司，澳大利亞）。p1300URF載體（圖1B）攜帶CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的HPT-mCherry融合基因。實(shí)驗(yàn)中以p1300UR-mC載體（圖1C）作為陽(yáng)性對(duì)照，攜帶Ubiqitin啟動(dòng)子（玉米泛素基因啟動(dòng)子）[15]驅(qū)動(dòng)的mCherry基因和CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的HPT基因。

為了構(gòu)建包含HPT-mCherry融合標(biāo)簽的p1300URF載體，通過(guò)序列分析，使得標(biāo)記基因HPT和mCherry通過(guò)一個(gè)短的多聚甘氨酸鏈相連，得到融合片段。該片段包括3個(gè)小片段，片段1包含部分HPT基因和Link序列,片段2包含mCherry基因和Link序列，片段3包含載體的部分序列。首先用引物P1和P2擴(kuò)增片段1、P3和P4擴(kuò)增片段2、P5和P6擴(kuò)增片段3，然后將上述PCR產(chǎn)物稀釋至1/100后作為模板，用引物P1和P6通過(guò)融合PCR技術(shù)[16]合成完整的改造片段。采用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，用RsrⅡ和SacⅡ酶切，將酶切片段連入經(jīng)相同的內(nèi)切酶酶切的目標(biāo)載體pCAMBIA1300UR，熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選正確克隆，保菌備用。引物及序列見(jiàn)表1。

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化

挑選飽滿(mǎn)的種子，去殼后置于50 mL無(wú)菌離心管中，用無(wú)菌水清洗1次；加入30 mL 75%乙醇消毒1 min；棄乙醇，用無(wú)菌水清洗后，加入30 mL次氯酸鈉（活性氯濃度為1.25%），攪拌后靜置30 min；棄次氯酸鈉，用無(wú)菌水清洗3次，轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基[17]中，28℃培養(yǎng)至得到愈傷顆粒。

將含有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌懸浮于A(yíng)AM培養(yǎng)液（D600nm=0.08～0.1）中，挑取誘導(dǎo)得到的水稻愈傷組織，置菌液中侵染15 min；棄上清，超凈臺(tái)中晾30～40 min；棄菌懸液，將愈傷組織置于共培養(yǎng)基[18]上，20℃暗培養(yǎng)3 d；用無(wú)菌水清洗愈傷組織5～6次，轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基[18]上光照培養(yǎng)20 d，用Leica熒光顯微鏡檢測(cè)帶有紅色熒光的愈傷組織，并將其轉(zhuǎn)移至新鮮的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第二輪選擇，直到顆粒性的抗性愈傷組織長(zhǎng)出；挑取抗性愈傷移入分化培養(yǎng)基[18]中，28℃培養(yǎng)至分化成苗。

1.4 轉(zhuǎn)基因材料的鑒定

水稻轉(zhuǎn)基因材料DNA的提取參考CTAB小量提取法[19]。用引物HPT-FL-F/HPT-FL-R進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR條件：95℃ 10 min；95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)。

1.5 轉(zhuǎn)基因水稻熒光檢測(cè)

用Leica熒光體式顯微鏡和BLS燈式熒光檢測(cè)器觀(guān)察轉(zhuǎn)化愈傷組織及轉(zhuǎn)化植株的紅色熒光。

表1 實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列

1.6 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄PCR

取100 mg水稻樣品置于預(yù)冷的研缽中，用液氮充分研磨，加入1 mL TRIzol試劑繼續(xù)研磨至粉末，按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取水稻總RNA，最后加入20～40 μL無(wú)RNase的水溶解RNA沉淀。用iScript cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。

1.7 熒光定量PCR檢測(cè)

用質(zhì)粒提取試劑盒提取p1300URF質(zhì)粒，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)粒濃度測(cè)量，并按下式計(jì)算質(zhì)粒摩爾濃度[20]：

將質(zhì)粒p1300URF進(jìn)行1/10梯度稀釋?zhuān)謩e稀釋為 105、106、107、108、109、1010和 1011copies/μL 共 7個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，作為模板；以mCherry-RT-F/mCherry-RT-R和HPT-RT-F/HPT-RT-R為引物，采用SsoFast EvaGreen Supermix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR（PCR 條 件 ：94℃ 3 min；94℃ 20 s、58℃ 20 s、72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)），然后根據(jù)7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值計(jì)算模板起始濃度，并以模板起始濃度為橫坐標(biāo)、Ct值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[21]。

2 結(jié)果

2.1 利用融合標(biāo)簽有效篩選陽(yáng)性愈傷

將包含p1300URF質(zhì)粒的農(nóng)桿菌與粳稻品種日本晴的愈傷組織進(jìn)行共培養(yǎng)，3 d后選擇培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中使用包含p1300UR-mC質(zhì)粒的農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作作為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)選擇20 d的愈傷組織進(jìn)行觀(guān)察，結(jié)果顯示，成功轉(zhuǎn)化的愈傷組織在515～588 nm激發(fā)光照射下發(fā)出紅色熒光，轉(zhuǎn)p1300URF愈傷組織的熒光強(qiáng)度較弱，但不影響mCherry作為報(bào)告基因篩選陽(yáng)性愈傷組織的功能（圖2A～D）。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)，p1300UR-mC和p1300URF分別轉(zhuǎn)化了306塊和301塊胚性愈傷組織，通過(guò)兩輪潮霉素篩選，分別獲得259塊和204塊獨(dú)立轉(zhuǎn)化的表達(dá)紅色熒光的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)化效率分別為84.6%和67.8%。上述結(jié)果表明，HPT與mCherry融合后，轉(zhuǎn)化效率雖然有所降低，HPT-mCherry融合標(biāo)簽中的HPT基因仍然可以有效篩選陽(yáng)性愈傷。結(jié)合熒光觀(guān)察，對(duì)照組和融合標(biāo)簽組都能進(jìn)一步快速篩選陽(yáng)性愈傷。

圖1 p1300UR（A）、p1300URF（B）和p1300UR-mC（C）載體圖

圖2 轉(zhuǎn)基因水稻熒光檢測(cè)

2.2 利用融合標(biāo)簽鑒定轉(zhuǎn)基因植株

對(duì)7 d苗齡的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行熒光檢測(cè)（圖2E、F），陽(yáng)性對(duì)照的根、芽和莖均有較強(qiáng)的紅色熒光，雖然受融合的HPT基因影響，轉(zhuǎn)p1300URF的植株熒光強(qiáng)度較弱，但紅色熒光仍然可以清晰地區(qū)分轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化植株。為進(jìn)一步驗(yàn)證融合標(biāo)簽熒光輔助篩選的有效性，我們隨機(jī)選取轉(zhuǎn)了14株轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，各陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株均擴(kuò)增得到1023 bp的片段（圖3），與通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察紅色熒光的檢測(cè)結(jié)果完全一致，說(shuō)明HPT-mCherry融合標(biāo)簽在轉(zhuǎn)基因鑒定中能夠替代常用PCR檢測(cè)方法，從而大量節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間和相關(guān)耗材。上述結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因植株中，HPT與mCherry融合后相互間影響較小，可以正常用于轉(zhuǎn)基因植株鑒定。

2.3 HPT和mCherry基因在mRNA水平上的表達(dá)分析

將濃度為105ng/μL（即 1.58×1013copies/μL）的質(zhì)粒 p1300URF分別稀釋至 105、106、107、108、109、1010和1011copies/μL作為模板，制作HPT和mCherry基因擴(kuò)增效率的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到HPT和mCherry標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.996。提取轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性愈傷和植株的總RNA進(jìn)行qRT-PCR，通過(guò)絕對(duì)定量PCR分析，得到各株系中HPT和mCherry的表達(dá)量分別為107.06和107.81copies/μL。從mRNA水平證明采用融合標(biāo)簽后，mCherry和HPT能在轉(zhuǎn)基因愈傷和植株中高效表達(dá)。參見(jiàn)圖4。

圖3 轉(zhuǎn)p1300URF的水稻植株HPT基因的PCR檢測(cè)

圖4 轉(zhuǎn)基因材料的絕對(duì)定量PCR分析

3 討論

隨著水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，轉(zhuǎn)化頻率不再是T-DNA轉(zhuǎn)化的主要限制因素。在水稻轉(zhuǎn)基因研究中，轉(zhuǎn)基因后代的鑒定和遺傳分析主要利用潮霉素抗性基因的PCR或GUS酶活性進(jìn)行檢測(cè)，但這些方法工作量大，比較費(fèi)時(shí)。mCherry是一個(gè)單體熒光蛋白，其波長(zhǎng)較長(zhǎng)（587/610 nm），成熟時(shí)間較短（t1/2≈0.25 h），在融合外源蛋白時(shí)受影響較少[22]。我們構(gòu)建了HPT-mCherry融合標(biāo)簽載體，并確認(rèn)了融合蛋白能有效發(fā)揮抗性基因功能，行使抗潮霉素的功能，也能有效地產(chǎn)生紅色熒光，從而實(shí)現(xiàn)可視化篩選。

用HPT-mCherry融合標(biāo)簽進(jìn)行鑒定，在避免了繁雜工作的同時(shí)保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。而且，該方法還避免了使用2套啟動(dòng)子和終止子分別控制HPT和mCherry的表達(dá)，有效減少了遺傳重組的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)避免了占用大量限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，方便了載體的進(jìn)一步使用。

[1]Nishizawa Y,Nishio Z,Nakazono K,et al.Enhanced resis?tance to blast(Magnaporthe grisea)in transgenic Japonica rice by constitutive expression ofrice chitinase[J].TheorAppl Genet,1999,99(3-4):383-390.

[2]唐甜甜,李浩,段永波,等.利用sgfp報(bào)告基因優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化[J].生物學(xué)雜志,2012,29(1):88-91.

[3]Hiei Y,Ohta S,Komari T,et al.Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and se?quence analysis of the boundaries of the T-DNA[J].Plant J,1994,6(2):271-282.

[4]董志峰,馬榮才,彭于發(fā),等.轉(zhuǎn)基因植物中外源非目的基因片段的生物安全研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào),2001,43(7):661-672.

[5]Ortiz J P A,Reggiardo M I,Ravizzini R A,et al.Hygromy?cin resistance as an efficient selectable marker for wheat sta?ble transformation[J].Plant Cell Rep,1996,15(12):877-881.

[6]Nakamura S,Mano S,Tanaka Y,et al.Gateway binary vec?tors with the bialaphos resistance gene,bar,as a selection marker for plant transformation[J].Biosci Biotechnol Biochem,2010,74(6):1315-1319.

[7]Vain P,Worland B,Kohli A,et al.The green fluorescent pro?tein(GFP)as a vital screenable marker in rice transformation[J].Theor Appl Genet,1998,96:164-169.

[8]Joersbo M,Okkels F T.A novel principle for selection of transgenic plant cells:positive selection Plant Cell Rep,1996,16(3):219-221.

[9]Miki B,McHugh S.Selectable marker genes in transgenic plants:applications,alternatives and biosafety[J].J Biotech?nol,2004,107(3):193-232.

[10]Cummins J,Ho M W,Ryan A.Hazardous CaMV promoter[J]?Nat Biotechnol,2000,18(4):363.

[11]Kohli A,Griffiths S,Palacios N,et al.Molecular characteriza?tion of transforming plasmid rearrangements in transgenic rice reveals a recombination hotspot in the CaMV 35S promoter and confirms the predominance of microhomology mediated re?combination[J].Plant J,1999,17(6):591-601.

[12]Baird G S,Zacharias D A,Tsien R Y.Biochemistry,mutagen?esis,and oligomerization of DsRed,a red fluorescent protein from coral[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(22):11984-11989.

[13]Matz M V,Fradkov A F,Labas Y A,et al.Fluorescent pro?teins from nonbioluminescent Anthozoa species[J].Nat Biotech?nol,1999,17(10):969-973.

[14]Zhou X,Carranco R,Vitha S,et al.The dark side of green fluorescent protein[J].New Phytologist,2005,168(2):313-322.

[15]Christensen A H,Quail P H.Ubiquitin promoter-based vec?tors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants[J].Transgenic Res,1996,5(3):213-218.

[16]Kim D,Seo H Y,Hayashi K.Construction and characteriza?tion of novel chimeric β-glucosidases with Cellvibrio gilvus(CG)and Thermotoga maritima(TM)byoverlappingPCR[J].Biotechnol Bioprocess Eng,2009,14:266-273.

[17]閻麗娜,李霞,吳丹.不同類(lèi)型水稻材料成熟胚組織培養(yǎng)力的比較[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(6):1127-1135.

[18]張春雨,李宏宇,劉斌.hpt與bar基因作為水稻轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記的比較研究[J].遺傳,2012,34(12):1599-1606.

[19]Doyle J A,Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochem Bull,1987,19(1):11-15.

[20]李慧鋒,李麗,張麗娟,等.PepT1基因絕對(duì)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(4):332-335.

[21]李麗,趙成萍,李宏,等.質(zhì)粒制備絕對(duì)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2011,19(6):1157-1162.

[22]Shaner N C,Campbell R E,Steinbach P A,et al.Improved monomeric red,orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp.red fluorescent protein[J].Nat Biotechnol,2004,22(12):1567-1572.