穩(wěn)定表達鼠源PLEKHA1細胞系的建立及其對細胞遷移的影響

查玉華，陳文霞，張鵬

軍事醫(yī)學科學院 附屬醫(yī)院，北京 100071

白細胞的遷移是炎癥發(fā)生過程中必不可少的步驟之一。在炎癥中，白細胞通過血管壁滲出到血管外并在炎癥部位聚集，稱為白細胞浸潤。單核/巨噬細胞是浸潤的主要白細胞之一[1]。浸潤到組織間隙的單核/巨噬細胞能夠發(fā)揮其吞噬功能，殺滅侵入的病原體，修復創(chuàng)傷組織；但同時也釋放大量炎癥因子、自由基及溶酶體酶，導致機體代謝紊亂和組織細胞損傷[2]。因此，揭示巨噬細胞遷移的調(diào)控機制十分重要。

在細胞遷移過程中，磷脂酰肌醇激酶（phospha?tidylinositol-3-OH kinase，PI3K）的激活起關(guān)鍵作用。PI3K的激活導致細胞內(nèi)磷脂酰肌醇三磷酸［phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PI（3，4，5）P3］的產(chǎn)生，而 PI（3，4，5）P3則是細胞極化遷移過程中的樞紐物質(zhì)[3-4]。PI（3，4，5）P3 可募集包含 Pleck?strin Homolgy（PH）結(jié)構(gòu)域的細胞骨架調(diào)控蛋白，啟動細胞骨架重組，細胞產(chǎn)生極化進而發(fā)生遷移[5]。PLEKHA1（PH domain-containing family A mem?ber 1）是包含PH結(jié)構(gòu)域蛋白超家族的一員，生物信息學分析表明其可能與PI（3，4，5）P3相結(jié)合[6]，但其對細胞遷移的調(diào)控作用未見報道。本研究旨在探討過表達PLEKHA1對巨噬細胞遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

293FT和RAW264.7細胞，質(zhì)粒pCMV-Myc-PLEKHA1為本室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌購自依科賽公司；攜帶加強型綠色熒光蛋白（eGFP）基因的慢病毒載體pCDH、包裝質(zhì)粒pMD和SPA由軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所蛋白質(zhì)組與基因組學研究室惠贈；LipofectAMINE 2000購自Invit?rogen公司；T4DNA連接酶、dNTP、PrimerSTAR HS高保真酶、DNA marker DL2000及限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ購自大連寶生物公司；質(zhì)粒提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒DNA膠回收純化試劑盒購自Promega公司；PLEKHA1抗體購自Santa Cruz公司；Transwell chambers購自Corning公司；N-formyl-me?thionyl-leucyl-phenylalanine（fMLP，F(xiàn)3506）購自 Sig?ma-Aldrich公司。

1.2 重組慢病毒載體的構(gòu)建

以pCMV-Myc-PLEKHA1為模板進行PCR，上下游引物分別為P1（5'-TACGAATTCACATGCCTT ATGTGGATCGACA-3'）和 P2（5'-CGCGGCCGCTTC ACACATCGCTGACTGGCAG-3'）（循 環(huán) 參 數(shù) ：94℃30 s、68℃ 2 min，30個循環(huán)）。純化后得到目的片段，經(jīng)雙酶切后重組入慢病毒載體pCDH，重組慢病毒載體經(jīng)雙酶切鑒定并測序。

1.3 慢病毒包裝

293FT包裝細胞（培養(yǎng)基為高糖DMEM添加10%胎牛血清，0.1 mmol/L NEAA，0.2 mol/L L-谷氨酰胺）培養(yǎng)至細胞對數(shù)生長期時接種，培養(yǎng)基中不加抗生素。以六孔板為例，總質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為6 μg，分別為 pMD 1 μg、SPA 2 μg、pCDH-PLEKHA1 3 μg。轉(zhuǎn)染后第 2 d換液，每孔加2 mL，轉(zhuǎn)染后48 h再補2 mL；轉(zhuǎn)染后72 h收上清，用0.22 μm濾器過濾，-70℃保存或立刻使用。

1.4 RAW264.7細胞的感染及篩選

六孔板鋪細胞，被感染細胞的密度以4 d后長滿為宜，病毒上清與完全培養(yǎng)基1∶1使用。4～5 d可見部分細胞發(fā)綠色熒光，此時用嘌呤霉素5 μg/mL處理24 h，然后換為新鮮的完全培養(yǎng)基，以促進細胞生長。

1.5 Western印跡

細胞用TNE裂解液［50 mmol/L Tris（pH7.4），150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，1%NP-40，加蛋白酶和磷酸酶抑制劑（Roche）］裂解，SDS-PAGE分離蛋白后電轉(zhuǎn)移至NC膜，用脫脂牛奶封閉液封閉1 h；加入一抗，室溫溫育2 h或4℃溫育過夜；用TBST洗膜3次，每次10 min；加入相應(yīng)的二抗，室溫溫育1 h；用TBST洗膜3次，每次10 min；將ECL顯色液加到膜上，用保鮮膜把膜包起來；暗室中X線膠片曝光，顯影、定影，流水沖洗X線膠片，干燥保存。

1.6 Transwell細胞遷移實驗

小室孔徑8 μm，直徑6.5 mm。將1×105細胞混懸于100 mL RPMI1640培養(yǎng)基中加入小室，下層培養(yǎng)孔加入1 nmol/L fMLP；24 h后用甲醇固定小室中細胞，再用結(jié)晶紫溶液（0.1%結(jié)晶紫，20%甲醇）染色10 min；將小室沖洗干凈，用棉簽擦掉小室內(nèi)側(cè)膜上的細胞；取下小室底膜，于載玻片上觀察拍照，隨機選取至少5個視野計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以 x±s表示，兩組間比較用 t檢驗，P＜0.05判斷為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒載體的酶切鑒定及測序結(jié)果

以pCMV-Myc-PLEKHA1質(zhì)粒為模板，PCR擴增PLEKHA1基因的重組慢病毒表達質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切后可獲得1200 bp的目的片段（圖1）。測序結(jié)果表明目的片段與NCBI公布的序列一致（未示）。

2.2 Western印跡檢測穩(wěn)定表達PLEKHA1的RAW264.7細胞

RAW264.7細胞分別感染對照病毒和PLEKHA1表達病毒，經(jīng)嘌呤霉素篩選，連續(xù)傳代5次后收集細胞進行Western印跡，以內(nèi)源抗體檢測。與對照組細胞相比，穩(wěn)定表達PLEKHA1的RAW264.7細胞的PLEKHA1蛋白表達水平提高近30倍（圖2），說明穩(wěn)定表達小鼠PLEKHA1的RAW264.7細胞系構(gòu)建成功。

2.3 PLEKHA1抑制巨噬細胞遷移

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

穩(wěn)定表達小鼠PLEKHA1的RAW264.7細胞系構(gòu)建成功后，采用Transwell方法研究PLEKHA1對巨噬細胞遷移的影響。計數(shù)聚碳酸酯膜下表面的細胞數(shù)，結(jié)果見圖3，PLEKHA1組穿過小室的細胞數(shù)明顯低于對照組（46±7 vs 18±4，P＜0.05）。

圖2 Western印跡檢測PLEKHA1的表達

圖3 細胞遷移實驗

3 討論

遷移是細胞最古老的行為之一。單細胞生物覓食，多細胞生物的發(fā)育、創(chuàng)傷愈合以及免疫反應(yīng)無不需要細胞遷移的參與。巨噬細胞的遷移更是與免疫反應(yīng)直接相關(guān)。巨噬細胞遷移異常，與動脈粥樣硬化、肥胖的發(fā)生密切相關(guān)[7-8]。因此，發(fā)現(xiàn)新的巨噬細胞遷移調(diào)控因子，對于深化對巨噬細胞相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的認識有重要作用。在本研究中，我們以小鼠RAW264.7巨噬細胞為研究對象，通過慢病毒介導的方法，獲得穩(wěn)定表達PH結(jié)構(gòu)域蛋白PLEKHA1的細胞株，并檢測了其遷移能力。結(jié)果顯示巨噬細胞中過表達PLEKHA1能使其遷移能力減弱，提示PLEKHA1是一個新的巨噬細胞遷移調(diào)控因子。這一細胞株的建立，也為進一步研究PLEKHA1在巨噬細胞相關(guān)病理生理過程中的作用及機制提供了模型。

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