甲醇-山梨醇混合碳源誘導(dǎo)提高抗HER2抗體在糖基工程畢赤酵母中的表達(dá)

高愛榮 ，劉波 ，唱韶紅 ，鞏新 ，徐敏銳 ，3，徐威 ，吳軍

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；2.沈陽藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；3.安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601

抗體等糖蛋白類藥物已成為發(fā)展最快的基因工程藥物，目前有幾十種治療性抗體已進(jìn)入市場，其中一半以上用于癌癥的治療，上百種抗體處于臨床研究階段[1]。但是，現(xiàn)在的抗體類藥物主要依賴于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，生產(chǎn)周期長，成本昂貴，限制了該類抗體的廣泛應(yīng)用[2]。為此，找到一種廉價的、可替代哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，已經(jīng)成為目前研究的熱點問題。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已成為一種成熟的蛋白表達(dá)技術(shù)平臺。作為簡單的真核生物，酵母具有培養(yǎng)成本低廉、工程菌構(gòu)建周期短、不含內(nèi)毒素、表達(dá)水平高等特點，同時具有大多數(shù)真核細(xì)胞的翻譯后修飾能力，并已長期用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。但是，野生型畢赤酵母表達(dá)的主要是高甘露糖型的糖蛋白，這種糖蛋白應(yīng)用于人體后，會很快被肝臟及一些淋巴細(xì)胞表面的甘露糖受體識別，因此易出現(xiàn)免疫原性及藥物清除過快等問題。這是限制畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用的重要原因之一。為了解決這一問題，近年來，國內(nèi)外研究者開展了一系列的酵母糖基工程改造。2006年，Gerngross等報道利用糖基工程技術(shù)對酵母菌進(jìn)行改造，工程酵母表達(dá)了具有哺乳動物復(fù)雜型糖基的抗CD20單抗，并發(fā)現(xiàn)該酵母工程菌表達(dá)的抗體比哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的抗體具有更強的ADCC（抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒）作用[3]；同年，Gerngross等又構(gòu)建了另一工程菌株，成功地利用該糖基工程酵母表達(dá)了具有唾液酸末端的復(fù)雜型糖基的促紅細(xì)胞生成素（EPO）[4]。

本實驗室正在進(jìn)行畢赤酵母糖基工程改造的研究，已成功構(gòu)建了過度甘露糖基化缺失的糖基工程酵母菌株GJK01[5]等，但要使酵母表達(dá)系統(tǒng)成為抗體等人用劑量較大糖蛋白的大規(guī)模、低成本的制備平臺，還需要解決全抗體在畢赤酵母中的高效表達(dá)和制備的問題。目前，關(guān)于全抗體在畢赤酵母中表達(dá)的報道還不多：1999年，Ogunjimi等在嗜甲醇畢赤酵母中成功地表達(dá)了第一個IgG[6]；2006年，Li等利用糖基工程酵母表達(dá)了具有人源化N-糖鏈并具有功能的全抗體[3]；2009～2011 年，Thomas等利用人源化改造的糖基化畢赤酵母獲得了含有復(fù)雜型N-糖鏈的全抗體，該抗體糖鏈末端含有半乳糖，與哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的Trastuzumab（曲妥珠單抗）相比具有更強的ADCC活性，經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化，全抗體表達(dá)量已經(jīng)達(dá)到1.9 g/L[7-9]。

在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中實現(xiàn)全抗體的表達(dá)涉及很多問題。例如，甲醇不僅是醇氧化酶啟動子的誘導(dǎo)物，又是蛋白表達(dá)過程中的主要能源和碳源，因此，甲醇的添加是外源蛋白表達(dá)的關(guān)鍵原因之一，但甲醇濃度過高可對菌體產(chǎn)生毒害作用。混合碳源補料可在一定程度上補充碳源的不足，又可避免高濃度甲醇可能引起的中毒?；旌咸荚囱a料有甲醇/甘油混合碳源、甲醇/山梨醇混合碳源等[10-11]。在此，我們以表達(dá)抗HER2單克隆抗體的糖基工程酵母菌株作為模式菌株，利用甲醇和山梨醇混合碳源誘導(dǎo)策略對全抗體的發(fā)酵表達(dá)進(jìn)行了初步探索。

人表皮生長因子受體2（human epidermal gor?wth factor receptor 2，HER2）屬于酪氨酸激酶受體家族，是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，其過度表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生有著密切的關(guān)系[12]?？笻ER2人源化單克隆抗體與HER2胞外區(qū)特異性結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞生長，可用于治療過量表達(dá)HER2受體的腫瘤——乳腺癌[13-14]，屬于IgG1亞類[15]。

1 材料與方法

1.1 材料

SK-BR-3細(xì)胞來自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會上海細(xì)胞庫；表達(dá)抗HER2單克隆抗體的糖基工程巴斯德畢赤酵母菌株由本實驗室構(gòu)建并保存[5,16]。酵母抽提物、胰蛋白胨購自O(shè)xoid公司；羊抗人IgG-HRP購自華美生物工程公司；商業(yè)化Her?ceptin（赫賽?。┵徸越夥跑?07醫(yī)院；其他試劑為分析純試劑。蛋白電泳儀、酶聯(lián)免疫檢測儀購自Bio-Rad公司；5L B5型貝朗發(fā)酵罐購自Sartorius公司；AKTA UPC900蛋白純化儀購自GE公司。

1.2 培養(yǎng)基

MD平板：YNB（無氨基酸酵母氮源）1.34%，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L。YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L。BMGY搖瓶培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，pH6.0，100 mmol/L磷酸緩沖液，YNB 1.34%，生物素4×10-5%，甘油10 g/L。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BSM）：H3PO43.5 mL/L，K2SO42.4 g/L，KOH 0.65 g/L，CaSO4（無水）0.14 g/L，MgSO4·7H2O 1.95 g/L，甘油40.0 g/L，PTMI 1.2 mL/L，500×生物素0.5 mL/L；高壓滅菌，氨水調(diào)pH6.0。補料生長培養(yǎng)基：500 g/L甘油（含12 mL/L PTMI，2 mL/L 500×生物素）。

PTM1：CuSO4·5H2O，6.0 g/L；MnSO4·H2O，3.0 g/L；FeSO4·7H2O，65 g/L；ZnSO4·7H2O，20 g/L；CoCl2·6H2O，0.5 g/L；NaMoO4·2H2O，0.2 g/L；KI，0.1 g/L；H2SO4，5 mL/L。

1.3 甲醇誘導(dǎo)濃度對抗體表達(dá)的影響

巴斯德畢赤酵母是一種甲醇利用型酵母菌，用搖瓶試驗分析甲醇濃度對抗體表達(dá)的影響。在誘導(dǎo)期向培養(yǎng)基中添加甲醇，濃度分別為0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%。每隔12 h誘導(dǎo)一次，誘導(dǎo)72 h收獲培養(yǎng)液。

1.4 抗HER2抗體抗原結(jié)合活性的測定[17]

SK-BR-3細(xì)胞是HER2基因高擴增和高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞，利用該細(xì)胞表達(dá)的HER2抗原與對應(yīng)抗體結(jié)合的特性，采用間接ELISA檢測畢赤酵母表達(dá)的抗HER2抗體與抗原的結(jié)合活性。

將SK-BR-3細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2水汽飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以1×105/mL的濃度鋪96孔板，培養(yǎng)至72 h，用戊二醛固定細(xì)胞，1%的BSA-PBS封閉2 h，棄封閉液，用0.1%的苯肼-PBS閉光作用1 h，棄苯肼液，用PBST洗滌4次，加入合適濃度的搖瓶表達(dá)抗體，37℃作用1 h；用0.1%的BSA-PBS洗滌4次，加入羊抗人IgG-HRP（1∶1000）50 μL/孔，37℃作用 1 h；用 PBST洗滌5次，每次盡量棄去殘液；每孔各加50 μL顯色液，37℃溫育15 min；每孔加50 μL終止液以終止顯色，測定D492nm值。

1.5 抗HER2抗體糖基工程酵母菌的發(fā)酵

1.5.1 種子培養(yǎng) 從新鮮MD平板上挑取重組糖基工程酵母菌的單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中，24℃、250 r/min培養(yǎng)約48 h，轉(zhuǎn)接于YPD搖瓶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基體積為300 mL，接種量為1%，25℃、250 r/min培養(yǎng)至菌液D600nm為10。

1.5.2 發(fā)酵培養(yǎng) 配制發(fā)酵培養(yǎng)基2.1 L，加入5 L發(fā)酵罐中，121℃、35 min高壓滅菌，待發(fā)酵罐降至室溫，以10%的接種量將搖瓶種子接入發(fā)酵罐，氨水控制pH6.0，溫度為24℃，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，維持溶氧在20%以上；當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)甘油耗盡時，溶氧回升，開始流加補料生長培養(yǎng)基；當(dāng)甘油耗盡時停止補料，開始甲醇誘導(dǎo)，溫度依然維持在24℃，調(diào)節(jié)pH值為6.4。起始階段，甲醇以2.4 mL/（L·h）開始流加，每小時增加終濃度的20%，5 h后增至12 mL/（L·h），此時記為誘導(dǎo)0 h；表達(dá)階段甲醇與山梨醇按照1∶1的摩爾比混合誘導(dǎo)，流加速度為12 mL/（L·h）；誘導(dǎo)表達(dá)96 h后結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵液于4℃、8000 r/min離心20 min，發(fā)酵液上清用于后續(xù)分析。

1.6 ELISA測定抗體的表達(dá)量[16]

將發(fā)酵培養(yǎng)液上清加入酶聯(lián)板中，用包被液倍比稀釋，4℃包被過夜，棄上清，用PBST洗滌3次，每孔分別加入300 μL 5%的奶粉封閉1.5 h；棄上清，用PBST洗滌1次，每孔加入300 μL羊抗人IgGHRP（用5%的奶粉稀釋至1/5000），37℃溫育1 h；用PBST洗滌5次，每次盡量棄去殘液；每孔各加100 μL顯色液，37℃溫育15 min；每孔加50 μL終止液以終止顯色，測定D492nm值；用已知濃度的IgG和D492nm值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算發(fā)酵液上清中抗HER2抗體的表達(dá)量。

1.7 發(fā)酵培養(yǎng)液中抗體的純化

收集發(fā)酵液，4℃、12 000 r/min離心20 min，棄沉淀，上清保存于-20℃?zhèn)溆?。收集的上清用陽離子交換柱分離純化，具體方法參見文獻(xiàn)[15]；采用Lowry法對純化的抗體進(jìn)行定量，參考中國藥典第二部[18]。

1.8 純化蛋白的Western印跡

純化樣品經(jīng)SDS-PAGE，采用半干式電轉(zhuǎn)移方法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，恒壓18 V，1.5 h；轉(zhuǎn)移完成后，將硝酸纖維素膜放在平皿中，加入封閉液［5%的脫脂奶粉溶于 PBST（PBST：0.01 mol/L PBS+0.05%Tween，pH7.4）］，37℃輕輕振蕩 2 h；封閉結(jié)束后洗掉硝酸纖維素膜上的封閉液，將硝酸纖維素膜浸泡在一抗溶液［含羊抗人IgG-HRP（1∶4000）的奶粉］中，室溫輕輕振蕩2 h；將硝酸纖維素膜用PBST洗5次，每次5 min；用濾紙稍微吸干硝酸纖維素膜上的PBST液體，放置在潔凈的保鮮膜上，將顯色底物（Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測試劑）溶液A和B等體積混合（這里各500 μL），均勻涂布于膜上的蛋白面，曝光顯色。

2 結(jié)果

2.1 搖瓶試驗確定抗體表達(dá)最佳的甲醇濃度

甲醇既是酵母自身生長必需的碳源，又是外源基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑，因此合適的甲醇濃度對于外源基因的表達(dá)有重要影響。我們研究了不同甲醇濃度對蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果如圖1。在搖瓶培養(yǎng)中，當(dāng)甲醇濃度由0.2%提高到0.5%時抗體表達(dá)量提高，而甲醇濃度由1%提高到3%的過程中蛋白表達(dá)量逐漸下降。分析可能是由于過高的甲醇濃度對細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用，從而造成抗體的分泌減少。

2.2 抗HER2抗體的抗原結(jié)合活性測定

抗HER2抗體靶向HER2的胞外區(qū)，我們采用間接ELISA實驗檢測抗體與抗原的結(jié)合活性，圖2結(jié)果顯示表達(dá)的抗HER2抗體能夠和SK-BR-3細(xì)胞表面表達(dá)的HER2抗原結(jié)合，具有抗原結(jié)合活性。

2.3 抗HER2抗體糖基工程酵母菌在5 L發(fā)酵罐中的培養(yǎng)

圖1 甲醇誘導(dǎo)濃度對抗HER2抗體表達(dá)的影響

在搖瓶實驗基礎(chǔ)上，我們在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了抗體表達(dá)菌株的發(fā)酵研究，主要探討了甲醇與山梨醇混合碳源誘導(dǎo)策略對抗體表達(dá)量的影響。整個發(fā)酵過程分為菌體生長階段、甘油補料階段和誘導(dǎo)階段（圖3）。當(dāng)pH值曲線和溶氧曲線都快速上升時，表明基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源消耗殆盡，進(jìn)入甘油補料階段。甘油補加完畢，進(jìn)入誘導(dǎo)補料階段。誘導(dǎo)起始適應(yīng)階段，為避免甲醇對酵母細(xì)胞的毒害作用，甲醇以2.4 mL/（L·h）的速率開始流加，每小時增加終濃度的20%，5 h后流加速率提至12 mL/（L·h），此時記為誘導(dǎo)0 h。誘導(dǎo)表達(dá)階段，甲醇/山梨醇按1∶1的摩爾比、12 mL/（L·h）的速率混合添加，誘導(dǎo)培養(yǎng)96 h后發(fā)酵結(jié)束。整個誘導(dǎo)過程中的菌體密度及抗體表達(dá)見圖4。誘導(dǎo)表達(dá)前，處于菌體的生長階段，經(jīng)過甘油補料培養(yǎng)階段，菌體大量增長，發(fā)酵上清中并無抗體表達(dá)；隨著甲醇誘導(dǎo)時間的延長，發(fā)酵液中的抗體不斷積累，菌體密度也在不斷提高。由圖5可知，甲醇和山梨醇混合添加策略使菌體生長加快，5 L罐中抗體的表達(dá)量達(dá)到了0.6 g/L。

圖2 抗HER2抗體的抗原結(jié)合活性測定

圖3 甲醇/山梨醇混合誘導(dǎo)補料的發(fā)酵過程圖

2.4 抗HER2抗體的純化與鑒定

發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)陽離子交換層析柱純化，對純化得到的抗體進(jìn)行還原及非還原SDS-PAGE分析（圖6）。從抗體條帶的位置判斷，還原電泳中抗體的輕重鏈相對分子質(zhì)量與商業(yè)化的Herceptin一致。非還原SDS-PAGE結(jié)果表明，純化樣品中含有完整的抗體分子，抗體相對分子質(zhì)量為1.5×105，表明其能夠通過二硫鍵的配對形成正確的四聚體結(jié)構(gòu)。用Lowry法對純化產(chǎn)物進(jìn)行濃度測定，測得純化的抗體濃度為0.365 g/L。

圖4 甲醇與山梨醇混合補料誘導(dǎo)策略的發(fā)酵SDS-PAGE圖譜

圖5 甲醇/山梨醇混合誘導(dǎo)策略對抗HER2抗體的表達(dá)及菌體生長的影響

圖6 純化蛋白的還原（A）和非還原（B）SDS-PAGE圖譜

圖7 純化蛋白的Western印跡還原電泳（A）和非還原電泳（B）

3 討論

本研究以表達(dá)抗HER2抗體的糖基工程酵母菌為模型，研究該類工程菌的發(fā)酵技術(shù)。首先，通過搖瓶試驗確定了合適的甲醇濃度，糖基工程畢赤酵母表達(dá)的抗HER2抗體具有SK-BR-3細(xì)胞抗原結(jié)合活性；然后在5 L發(fā)酵罐中，利用甲醇和山梨醇混合誘導(dǎo)方式發(fā)酵，抗體的表達(dá)量比搖瓶誘導(dǎo)提高了近10倍；非還原SDS-PAGE及Western印跡表明抗體分子大小與商業(yè)化抗體Herceptin一致。上述結(jié)果表明，采用甲醇-山梨醇混合碳源誘導(dǎo)方式發(fā)酵，能夠提高抗HER2抗體在糖基工程酵母中的表達(dá)量。本研究可為抗體在酵母中的規(guī)模發(fā)酵技術(shù)提供重要參考。

目前，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已成功表達(dá)了多種抗體及抗體片段，如抗CD20、ALD518、ScFv、Fab等，尤其是抗體片段的發(fā)酵表達(dá)量已超過8 g/L。2011年，Merck公司利用氧限制方法，將抗HER2抗體的表達(dá)量提高到1.9 g/L。我們采用Mut+型高表達(dá)菌株，經(jīng)過搖瓶試驗驗證該菌誘導(dǎo)控制的最適甲醇濃度為0.5%，發(fā)現(xiàn)過高的甲醇不利于菌體生長，還會出現(xiàn)菌體死亡、裂解釋放蛋白酶等，從而降低表達(dá)量。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了混合補料發(fā)酵對抗體表達(dá)量的影響研究，發(fā)現(xiàn)山梨醇和甲醇混合補料有助于表達(dá)量的提高。與傳統(tǒng)的甲醇誘導(dǎo)方式相比，混合補料具有很多優(yōu)點。山梨醇是一種非抑制性碳源，相關(guān)報道表明，山梨醇與甲醇共同誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)時，二者具有不同的代謝途徑，甲醇代謝有利于產(chǎn)生外源蛋白表達(dá)所需的能量，但同時也產(chǎn)生了對酵母細(xì)胞有害的甲醛，而山梨醇則進(jìn)入EMP途徑和TCA循環(huán)，產(chǎn)生蛋白合成必要的能量ATP。因此，山梨醇的加入緩解了甲醇單獨誘導(dǎo)表達(dá)能量不足的壓力和甲醇積累造成細(xì)胞毒性的問題[19]，其輔助甲醇進(jìn)行抗體的誘導(dǎo)表達(dá)是可行并且有效的。

可作為酵母碳源的化合物有多種，除山梨醇外還包括甘油、乳酸、小分子有機酸等。甘油與甲醇混合添加是研究較早的一種混和碳源流加方式，適量的添加可以提高細(xì)胞的生長活力，但添加過量就會產(chǎn)生對AOX啟動子具有抑制作用的乙醇，從而影響產(chǎn)量[20]；乳酸雖不會抑制啟動子AOX的表達(dá)，但它是弱酸，會改變發(fā)酵體系的pH值；也可以加入一些小分子有機酸的緩沖體系，其作為碳源的同時穩(wěn)定了發(fā)酵體系的pH值[21]。本研究采用甲醇/山梨醇混合碳源流加策略，進(jìn)一步證實了山梨醇有益于外源蛋白的表達(dá)。

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