人參附子不同比例配伍對小鼠急性毒性的影響*

周思思 ，馬增春 ，梁乾德 ，湯響林 ，王宇光 ，譚洪玲 ，肖成榮，張伯禮，高 月

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥理毒理研究室，北京 100850；2.安徽醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，合肥 230032；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

參附湯是臨床常用的經(jīng)典名方，由人參、附子兩味組成，補(bǔ)后天之氣無如人參，補(bǔ)先天之氣無如附子，此參附湯之所由立也。人參具有“回陽氣于垂絕，卻虛邪于俄頃”之能，附子更可“引補(bǔ)氣藥行十二經(jīng)，以追復(fù)散失之元陽”。故人參與附子多用于疾病甚篤之時(shí)，發(fā)揮力挽狂瀾、起死回生之功，為氣衰微欲脫之要方[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，治療心力衰竭的機(jī)制主要包括增強(qiáng)心肌收縮力、擴(kuò)張冠狀動脈、減少心肌細(xì)胞氧耗量等[2-4]。

宋元明清時(shí)期對參附湯有諸多記載，然而在藥物用量、用法、主治等方面卻不盡相同，人參附子比例為1∶2的有嚴(yán)氏、危氏和元氏參附湯3方，人參附子比例1∶1的有薛氏參附湯。這兩種比例下的參附湯主要用于真陽不足、陽虛氣虛之證。更多的參附湯是附子用量少于人參，所針對的病證在陽虛氣虛加重的基礎(chǔ)上，或多或少地伴有陰脫虛寒之象，在藥物用量方面，有附子用量下降及人參用量上升的趨勢[5]。從藥效角度探討人參附子配伍規(guī)律已有文獻(xiàn)報(bào)道[4]。筆者運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)和固定附子劑量與人參不同配比兩種方法，考察人參附子不同比例配伍對小鼠急性毒性的影響，旨在從毒性角度考察人參附子配伍是否減毒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 KM種小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SCXK-（軍）2007-004。

1.1.2 藥材來源 人參（批號20110901，產(chǎn)地東北吉林），附子（批號20120317,產(chǎn)地四川江油）。由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院馬百平教授鑒定，人參為五加科多年生草本植物人參的干燥根，附子為毛茛科多年生草本植物烏頭（Aconitum carmichaeli Debx.）子根。

1.1.3 儀器 電子調(diào)溫電熱套，98-1-B型，天津市泰斯特儀器有限公司。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，RE52CS型，上海亞榮生化儀器廠。電熱恒溫水浴鍋，北京長安科學(xué)儀器廠。SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。電子天平，BS 223S型，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備

1.2.1.1 附子提取液制備 取塊狀附子，粉碎，稱質(zhì)量，置于圓底燒瓶中，加入8倍量去離子水，浸泡8h，待煮沸后加熱回流提取30 min，濾過，減壓濾液濃縮至實(shí)驗(yàn)所需體積，4℃保存，備用。

1.2.1.2 參附湯的制備 取塊狀附子粉碎、干燥人參粉碎，稱質(zhì)量，按照實(shí)驗(yàn)所需比例混勻，分別置于圓底燒瓶中，加入8倍量去離子水，浸泡8 h，待煮沸后加熱回流提取30 min，濾過，減壓濾液濃縮至所需體積，4℃保存，備用。

1.2.2 附子急性毒性評價(jià) 按照國家食品藥品監(jiān)督管理局制定的《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（GLP）》以及《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，參照Bliss等方法進(jìn)行小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，小鼠常規(guī)飼養(yǎng)數(shù)天適應(yīng)環(huán)境后，將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)均勻分組，分6組，給藥劑量間距比值為0.678，小鼠禁食12 h，不禁水，0.04mL/g灌胃給藥，觀察14d。應(yīng)用DAS3.0版Bliss法正規(guī)LD50統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算半數(shù)致死量（LD50）。

1.2.3 附子與人參配伍均勻設(shè)計(jì)方法

1.2.3.1 劑量的確定 根據(jù)藥典規(guī)定的臨床用量，折算成小鼠給藥劑量，并根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，附子最大劑量設(shè)為LD50，最小劑量設(shè)為臨床常用安全劑量的最小量。人參最大劑量設(shè)為0.5 MTD，最小劑量設(shè)為臨床最低有效量。各按等比數(shù)列依次計(jì)算各組劑量[6]。人參最大給藥量經(jīng)實(shí)驗(yàn)為80 g/kg，最終確定劑量范圍：附子0.60～11.06 g/kg，人參1.21～40.00 g/kg。

1.2.3.2 因素與水平采用均勻設(shè)計(jì)U7（72）表[7]，將兩味藥物給藥劑量作為考察因素，每個(gè)因素各取7個(gè)水平，附子與人參配伍均勻設(shè)計(jì)的考察因素及水平見表1，劑量配比見表2。

表1 附子與人參配伍均勻設(shè)計(jì)的因素與水平Tab.1 Homogeneous design of Radix Ginseng and Radix Aconiti Lateralis Preparata g/kg

1.2.4 固定附子LD50與人參不同配比的減毒作用研究 固定附子 LD50，人參與附子按照 1∶6，1∶4，1∶2，1∶1，2∶1，4∶1，6∶1 共 7 個(gè)比例，分別制成參附湯劑，見表3。為了確保附子的單因素水平，人參與附子的不同比例實(shí)驗(yàn)的加水量統(tǒng)一加入700 mL，以消除加水量對附子中毒性成分的溶出影響。煎藥方法見表3。附子的劑量為其LD5011.064 g/kg，按照0.4 mL/10 g給藥計(jì)算得出給藥濃度。小鼠常規(guī)飼養(yǎng)數(shù)天適應(yīng)環(huán)境后，將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)均勻分組，分7組，小鼠禁食12 h，不禁水，0.04 mL/g灌胃給藥，觀察14 d。

表2 附子與人參配伍均勻設(shè)計(jì)的劑量配比Tab.2 The dose ratio in homogeneous design of Radix Ginseng and Radix Aconiti Lateralis Preparata g/kg

表3 參附湯劑的制備Tab.3 Preparation of Radix Ginseng and Radix Aconiti Lateralis Preparata decoction

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件，Mathematics7.0軟件包，均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院統(tǒng)計(jì)教研室提供。對均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果作逐步回歸分析及F檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn) 附子單煎液不同濃度灌胃給藥，附子組給藥后1 min高劑量組開始出現(xiàn)小鼠死亡，各組小鼠死亡時(shí)間主要集中在5～10 min，中毒反應(yīng)主要表現(xiàn)為抽搐，躁動，大小便失禁，心跳加快等。尸檢肉眼下未見主要臟器有明顯病變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。附子單煎液灌胃給藥小鼠的LD50（Bliss法）為 11.064 g/kg，95%可信限為 8.961～13.661 g/kg。

2.2 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對小鼠的毒性結(jié)果見表5，利用SAS軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到擬合回歸方程為z=0.0493x-0.00166xy，x：附子給藥劑量（k/kg），y：人參給藥劑量（k/kg），z：死亡率。該回歸方程經(jīng)F檢驗(yàn)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0001）。用Mathematics 7.0軟件包計(jì)算回歸方程在三維空間的分布圖（圖1），小鼠的死亡率越大，表明藥對的毒性越強(qiáng)。由圖1看出隨著附子給藥劑量的增多，小鼠的死亡率呈上升趨勢，且隨著人參對附子的比例增大，減毒作用呈現(xiàn)增大趨勢，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，人參與附子配伍具有顯著的減毒作用。

表4 附子單煎液灌胃給藥小鼠死亡率Tab.4 Mortality of Radix Aconiti Lateralis Preparata decoction by intragastric administration

表5 附子與人參配伍均勻?qū)嶒?yàn)對小鼠毒性的影響Tab.5 The influence of homogeneous compatibility of Radix Ginseng and Radix Aconiti Lateralis Preparata on acute toxicity in mice

圖1 回歸方程在三維空間的分布圖Fig.1 Scattergram of regression equation in three dimensions

2.3 固定附子LD50與人參不同配比的減毒作用研究 附子人參不同配比灌胃給藥，出現(xiàn)死亡的1，2，3 組里，小鼠的死亡時(shí)間集中在 5～30 min，中毒反應(yīng)仍然表現(xiàn)為抽搐，躁動，大小便失禁，心跳加快等。尸檢肉眼下未見主要臟器有明顯病變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。結(jié)果表明人參與附子配伍的減毒作用在一定范圍內(nèi)隨著人參劑量的增加而增加，尤其在人參∶附子為1∶1及大于1∶1時(shí)更明顯。從小鼠的死亡時(shí)間看，出現(xiàn)死亡時(shí)間延遲的現(xiàn)象，這也是人參附子配伍減毒的一個(gè)體現(xiàn)。

表6 固定附子LD50與人參不同配比的減毒作用研究Tab.6 The toxicity of fixed dose of Radix Aconiti Lateralis Preparata with different compatibility of Radix Aconiti

3 討論

附子，辛、甘，大熱，有毒。其性剛烈迅捷，通上達(dá)下，行表徹里，補(bǔ)火助陽，溫通諸經(jīng)，乃治療陽虛諸證及寒凝痛證之要藥?，F(xiàn)代臨床廣泛用于休克、心臟病、腎病、關(guān)節(jié)痛、腫瘤等的治療。其主要成分為劇毒的二萜雙酯類生物堿、次烏頭堿、烏頭堿等烏頭類生物堿[8-11]。如何在臨床應(yīng)用中既保證療效，又盡可能降低其毒性反應(yīng)，是附子應(yīng)用研究的關(guān)鍵問題。

附子大毒，人參制約彼此相畏為用,可以起到減毒作用，附子與人參配伍可調(diào)正固本以制其毒，人參能增強(qiáng)機(jī)體對有害刺激的非特異性抵抗力，顯著降低附子毒性，并能對抗附子加快心率和引起心律失常的不良反應(yīng)[12-13]。人參、附子配伍構(gòu)成的參附湯始載于《濟(jì)生續(xù)方》，歷代醫(yī)家在此基礎(chǔ)上靈活加減有所發(fā)揮。人參少于附子用量參附湯主要用于真陽不足、陽虛氣虛之證，附子用量少于人參者所針對的病證在陽虛氣虛加重的基礎(chǔ)上或多或少地伴有陰脫虛寒之象。在藥物用量方面，有附子用量下降及人參用量上升的趨勢，如在宋代，附子多用1兩，明清常降至幾錢；而人參則由半兩增加至幾兩，與現(xiàn)在臨床應(yīng)用基本相同[5]?，F(xiàn)代對附子的臨床用量，權(quán)威書籍規(guī)定及臨床報(bào)道也不一致，如2010年版《中華人民共和國藥典》載附子用量為3~15 g；云南名醫(yī)吳佩衡治療一般性虛寒證時(shí)附子用量通常為20~100 g，急性陰陽格拒、陰盛陽虛之危候，則為60~250 g[14]。

均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，隨著附子給藥劑量的增多，小鼠的死亡率呈上升趨勢，且隨著人參對附子的比例增大，減毒作用呈現(xiàn)增大趨勢。固定附子LD50與人參不同配比的減毒作用研究結(jié)果表明，人參與附子配伍的減毒作用在一定范圍內(nèi)隨著人參劑量的增加而增加，尤其在人參∶附子為1∶1及大于1∶1時(shí)更明顯。

人參附子不同比例配伍對小鼠急性毒性影響的實(shí)驗(yàn)說明，人參附子配比1∶1為參附配伍減毒作用的分界點(diǎn)，參附湯中人參附子配比小于1∶1主要用于真陽不足、陽虛氣虛的危重之證；人參附子配比大于1∶1主要用于陽虛氣虛伴有陰脫虛寒之證，現(xiàn)在正以動物心功能和心律不齊為指標(biāo)，深入考察人參附子不同比例配伍的減毒作用。

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