滋補(bǔ)肝腎復(fù)方對(duì)MCAO大鼠腦組織MLCP的調(diào)控作用*

胡懷強(qiáng)，周永紅，王樹才，曹秉振

（1.中國(guó)人民解放軍濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，濟(jì)南 250031；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青島 266071）

腦梗死后神經(jīng)功能重塑的因素十分復(fù)雜，包括促進(jìn)因素和抑制因素，能否有效解除抑制效應(yīng)是中樞神經(jīng)再生的關(guān)鍵[1]。Rho/ROCK信號(hào)通路在傳導(dǎo)髓磷脂相關(guān)抑制因子引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組、生長(zhǎng)錐塌陷及抑制神經(jīng)突起延伸過程中起著關(guān)鍵作用，已成為神經(jīng)損傷發(fā)生的重要病理機(jī)制[2]。研究表明[3]，滋補(bǔ)肝腎復(fù)方可以誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生有利的微環(huán)境促進(jìn)神經(jīng)再生，并顯著抑制Nogo-A表達(dá)，促進(jìn)腦梗死后的神經(jīng)發(fā)生。本研究首次通過給予滋補(bǔ)肝腎復(fù)方，觀察局灶性腦缺血模型大鼠梗死周圍腦組織中Rho/ROCK信號(hào)通路的關(guān)鍵因子肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）的變化，探討滋補(bǔ)肝腎復(fù)方在腦梗死后神經(jīng)再生、功能重塑中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和分組 成年無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250~300 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK（魯）20090001（山東省科學(xué)技術(shù)廳），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：魯動(dòng)質(zhì)號(hào)0005215（山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)），檢疫后備用，自由攝食進(jìn)水。顆粒大鼠飼料，由濟(jì)南康大飼料與山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心聯(lián)合生產(chǎn)，許可證號(hào)：魯飼準(zhǔn)字364號(hào)。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物飼養(yǎng)及取材均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)買后，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)預(yù)適應(yīng)飼養(yǎng)1周，1周后按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為：正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組和藥物組共4個(gè)大組，正常對(duì)照組、假手術(shù)組各10只，模型組和藥物組各20只。

1.2 藥物與試劑 滋補(bǔ)肝腎復(fù)方，主要藥物為何首烏、草決明、桑寄生、海馬、淫羊藿等，由山東魯信藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：2011040101，并按照成人劑量的20倍[9 g/（kg·d）]將其制成水溶液，濃度為0.9 g/mL（即10 mL/kg），置于4℃冰箱中備用。兔抗大鼠MLCP多克隆抗體，由Sigma-Aldrich公司提供。

1.3 大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型的制備 在Longa EZ等[4]報(bào)道的方法基礎(chǔ)上改良后行MCAO術(shù)制作局灶性腦缺血模型。MCAO模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)采用Longa EZ評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]：0分，無(wú)神經(jīng)缺損表現(xiàn)；1分，對(duì)側(cè)前爪不能充分伸展；2分，向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分，不能行走，意識(shí)喪失。動(dòng)物清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，1~3分者為納入標(biāo)準(zhǔn)，0分和4分者剔除。

1.4 給藥方法 于造模成功24 h后給藥，藥物組灌胃給予滋補(bǔ)肝腎復(fù)方水溶液10 mL/kg，余各對(duì)照組分別灌胃給予10 mL/kg的蒸餾水，每日1次，并于取材當(dāng)天停藥。固體飼料和水自由攝取。

1.5 標(biāo)本制備 在取材的各時(shí)間點(diǎn)，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（PBS）灌注固定取腦，然后將其浸于4%多聚甲醛中后固定。常規(guī)脫水浸蠟包埋，于正中隆起水平在切片機(jī)上行4 μm連續(xù)冠狀切片。

1.6 腦梗死體積測(cè)定及比較 每組大鼠于造模1周神經(jīng)功能缺損評(píng)分后迅速斷頭取腦，放入預(yù)冷的生理鹽水中，并在-20℃冰箱放置10 min，使腦微硬，去掉嗅球、小腦和低位腦干，剩下的部分沿視交叉從前至后立即冠狀切成5片，經(jīng)2%氯化三苯基四氮哇（TTC）37℃染色30 min后，用10%的甲醛緩沖液固定過夜。HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)測(cè)量各層梗死灶面積并儲(chǔ)存，計(jì)算體積。計(jì)算公式V＝∑[（S1+S2）÷2×h]（V：總?cè)莘e；S1，S2：每一切片上下兩面病灶面積；h：層面厚度）[5]，以梗死灶體積占全腦體積的百分率進(jìn)行分析。

1.7 免疫組織化學(xué)染色 切片常規(guī)脫蠟至水。30%雙氧水（H2O2）1份+蒸餾水10份混合，室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次。熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0），電爐加熱至沸騰后斷電，間隔10 min后，反復(fù)1次，自然冷卻后用PBS（pH 7.2~7.6）洗滌2次；滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗；滴加兔抗大鼠MLCP多克隆抗體（1∶80），4 ℃過夜，PBS（pH 7.2~7.6）洗2 min，3 次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃20min。PBS（pH 7.2~7.6）洗2 min，3 次；滴加試劑 SABC，37 ℃ 20 min，PBS（pH 7.2~7.6）洗5 min，4 次；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色：使用DAB顯色試劑盒，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌；脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。免疫組織化學(xué)染色陰性對(duì)照用生物素化山羊抗兔IgG代替一抗，其余步驟同上，以檢查ROCK2免疫反應(yīng)的特異性。

1.8 圖像分析 免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)切片在統(tǒng)一放大倍數(shù)下，隨機(jī)選10個(gè)視野，運(yùn)用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，記錄平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SAS8.1版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滋補(bǔ)肝腎復(fù)方對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能的影響 根據(jù)Longa EZ評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)治療后各組MCAO大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果見表1。

表1 滋補(bǔ)肝腎復(fù)方對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能的影響（±s）Tab.1 Effect of compound prescription of nourishing liver and kidney on the the neural function of the MCAO rats（±s） 分

表1 滋補(bǔ)肝腎復(fù)方對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能的影響（±s）Tab.1 Effect of compound prescription of nourishing liver and kidney on the the neural function of the MCAO rats（±s） 分

注：與正常對(duì)照組比較，▲t=5.80，P＜0.01；治療后與模型組比較，△t=5.42，P＜0.01。

組別 n Longa EI評(píng)分正常對(duì)照組 5 0.00±0.00假手術(shù)組 5 0.00±0.00模型組 7 2.71±0.49藥物組 7 1.29±0.49▲△

應(yīng)用Longa EZ評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)治療1周后的各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，藥物組的神經(jīng)功能評(píng)分較較模型組降低，差異有顯著性意義，表明滋補(bǔ)肝腎復(fù)方可有效改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀。

2.2 滋補(bǔ)肝腎復(fù)方對(duì)MCAO大鼠腦梗死體積的影響 通過TTC染色觀察了滋補(bǔ)肝腎復(fù)方對(duì)各組MCAO大鼠的腦梗死體積的影響，結(jié)果見表2。

表2 滋補(bǔ)肝腎復(fù)方對(duì)MCAO大鼠腦梗死體積的影響（s）Tab.2 Effect of compound prescription of nourishing liver and kidney on the brain infarct volume of the MCAO rats（±s）%

表2 滋補(bǔ)肝腎復(fù)方對(duì)MCAO大鼠腦梗死體積的影響（s）Tab.2 Effect of compound prescription of nourishing liver and kidney on the brain infarct volume of the MCAO rats（±s）%

注：與正常對(duì)照組比較，▲t＝20.81，P＜0.05；與模型組比較：△t＝7.43，P＜0.01。

組別 n 梗死體積正常對(duì)照組 5 0.00±0.00假手術(shù)組 5 0.00±0.00模型組 7 23.16±2.14藥物組 7 15.57±1.65▲△

TTC是一種水溶性鹽類物質(zhì)，它可以與活細(xì)胞線粒體脫氫酶反應(yīng)生成深紅色脂溶性物質(zhì)，死亡細(xì)胞由于線粒體內(nèi)脫氫酶失活而不顯色。即正常組織染成均勻的玫瑰紅色，而梗死灶呈白色。正常對(duì)照組及假手術(shù)組腦組織呈均勻紫紅色，沒有梗死灶。模型組腦切片上左側(cè)大腦半球有大面積蒼白梗死區(qū)，而藥物組平均梗死體積測(cè)定值明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明滋補(bǔ)肝腎復(fù)方可明顯減小血管閉塞后腦組織的梗死體積。

2.3 滋補(bǔ)肝腎復(fù)方對(duì)MCAO大鼠MLCP的影響 采用免疫組織化學(xué)方法觀察MCAO大鼠梗死腦組織周圍MLCP表達(dá)，結(jié)果見表3及圖1-4。

表3 滋補(bǔ)肝腎復(fù)方對(duì)MCAO大鼠腦組織MLCP表達(dá)的影響（±s）Tab.3 Effect of compound prescription of nourishing liver and kidney on the expression of MLCP in brain tissue in rats with MCAO（±s）

表3 滋補(bǔ)肝腎復(fù)方對(duì)MCAO大鼠腦組織MLCP表達(dá)的影響（±s）Tab.3 Effect of compound prescription of nourishing liver and kidney on the expression of MLCP in brain tissue in rats with MCAO（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，P＜0.01。

組別 n 吸光度（A）正常對(duì)照組 5 5.01±0.85假手術(shù)組 5 5.16±2.08模型組 7 17.91±2.82藥物組 7 10.20±4.77*△

圖1 正常對(duì)照組（10×40）Fig.1 Normal control（10×40）

圖2 假手術(shù)組（10×40）Fig.2 Sham operation group（10×40）

圖3 模型組（10×40）Fig.3 Model group（10×40）

圖4 藥物組（10×40）Fig.4 Treatment group（10×40）

結(jié)果顯示，腦梗死后1周時(shí)正常對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠腦內(nèi)的MLCP呈低表達(dá)狀態(tài)，兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大鼠腦梗死后腦內(nèi)的MLCP表達(dá)增高，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明腦梗死后神經(jīng)再生抑制相關(guān)因子開始表達(dá)。藥物組與模型組比較顯示，藥物組大鼠腦組織中MLCP表達(dá)雖然較正常對(duì)照組增多，但較模型組明顯減少，兩者之間有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明滋補(bǔ)肝腎復(fù)方可抑制MLCP在腦梗死后的表達(dá)。

3 討論

近年來研究表明抑制因素在神經(jīng)再生過程中扮演著更為重要的角色，迄今中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂相關(guān)的3種主要軸突再生抑制因子已被鑒定，包括Nogo、MAG、OMgp[5]。大量文獻(xiàn)資料表明這3種髓磷脂相關(guān)抑制因子完全依賴與NgR/P75NTR/Lingo-1膜受體復(fù)合物結(jié)合激活Rho/ROCK信號(hào)通路[6-7]。Rho/ROCK信號(hào)通路被稱為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)器，也是細(xì)胞形態(tài)異質(zhì)性的調(diào)節(jié)器[8]。激活后的Rho/ROCK可以影響許多生物學(xué)行為，包括細(xì)胞骨架的組裝、轉(zhuǎn)錄因子的激活、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)等，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與調(diào)節(jié)突觸可塑性。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)發(fā)育過程中，Rho/ROCK信號(hào)通路參與生長(zhǎng)錐的塌陷、抑制軸突發(fā)展和短期包繞細(xì)胞體等[9]。Rho/ROCK通路參與從軸突生長(zhǎng)抑制因子到生長(zhǎng)錐的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架信號(hào)換能過程[10]。因此，Rho/ROCK信號(hào)通路在傳導(dǎo)髓磷脂相關(guān)抑制因子引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組、生長(zhǎng)錐塌陷及抑制神經(jīng)突起延伸過程中起著關(guān)鍵作用，已成為神經(jīng)損傷發(fā)生的重要病理機(jī)制[11]。由此可見，阻斷Rho/ROCK信號(hào)通路可促進(jìn)軸突再生及神經(jīng)功能恢復(fù)[12]。

MLCP是一種肌球蛋白限制的特異性去磷酸化Thr-18、Ser-19的磷酸酶，由38 kU催化亞單位（protein phosphatase 1c）、110~130 kU 調(diào)節(jié)亞單位（MBS或MYPT 1）和20 kU肌動(dòng)蛋白結(jié)合亞單位組成。其調(diào)節(jié)亞單位MYPT 1接受Rho/ROCK的活化信號(hào)發(fā)生磷酸化修飾，導(dǎo)致MLCP失活[13]，從而失去對(duì)已磷酸化肌球蛋白的脫磷酸作用，使得胞漿內(nèi)磷酸化肌球蛋白輕鏈（MLC）水平增高，肌動(dòng)—肌球蛋白交聯(lián)增加，從而影響肌動(dòng)蛋白聚集和解聚過程，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白微絲骨架的收縮與聚合，最終導(dǎo)致生長(zhǎng)錐塌陷、回縮，軸突生長(zhǎng)停止[14-15]。Rho激酶抑制劑可顯著降低移植細(xì)胞凋亡、增加細(xì)胞繁殖能力、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生[16]。

中醫(yī)認(rèn)為，腦梗死的主要病機(jī)是機(jī)體在各種病理因素作用下，機(jī)體陰陽(yáng)失調(diào)，肝腎陰精受損，風(fēng)火痰氣血等病理產(chǎn)物旋而變生，在各種誘因作用下引發(fā)而致。其病機(jī)關(guān)鍵為肝腎陰虛，肝腎陰虛成于中風(fēng)之先，是腦梗死發(fā)病的根本。中醫(yī)腦髓與中樞神經(jīng)在解剖上具有同源性，肝腎與腦髓密切相關(guān)性，滋補(bǔ)肝腎使腎精充足，腦髓得養(yǎng)，神機(jī)得復(fù)，對(duì)維持腦內(nèi)神經(jīng)元的相對(duì)恒定，抗損傷修復(fù)機(jī)制中占主導(dǎo)地位，因此滋補(bǔ)肝腎是促進(jìn)中樞神經(jīng)再生的重要方法[17]。滋補(bǔ)肝腎復(fù)方是山東省名中醫(yī)藥專家王新陸教授所創(chuàng)，是臨床治療腦梗死的有效方劑，由何首烏、桑寄生、草決明、海馬、淫羊藿組成，此方針對(duì)腦梗死“肝腎陰虛為本”的病機(jī)特點(diǎn)而設(shè)，旨在滋補(bǔ)肝腎。方中諸藥合用，一則靶向明確，二則燮理陰陽(yáng)，三則肝腎并補(bǔ)，四則峻緩適宜，并具有補(bǔ)中寓行，寓調(diào)于補(bǔ)，調(diào)補(bǔ)結(jié)合，滋而不膩的特點(diǎn)。研究結(jié)果表明，藥物組大鼠腦組織中MLCP表達(dá)雖然較正常對(duì)照組增多，但較模型組明顯減少，說明滋補(bǔ)肝腎復(fù)方可抑制MLCP在腦梗死后的表達(dá)。表明滋補(bǔ)肝腎復(fù)方可通過抑制神經(jīng)生長(zhǎng)負(fù)性調(diào)控因子的表達(dá)，而對(duì)腦梗死后的神經(jīng)發(fā)生過程有促進(jìn)作用。

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