火針干預(yù)脊髓損傷大鼠后血清對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響

李 巖 ，周 震 ，程素利 ，焦召華 ，陳 爽

（1.天津市公安醫(yī)院，天津 300042；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,天津 300150；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

脊髓損傷（SCI）是交通事故、工礦事故及自然災(zāi)害中常見的、嚴(yán)重危害人類健康的疾病，患者多出現(xiàn)損傷平面以下的感覺、運(yùn)動(dòng)障礙及尿便功能異常[1]。目前，國內(nèi)外對(duì)于SCI的治療研究多集中在具有自我更新和定向分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）上[2]。筆者在臨床應(yīng)用火針多年，發(fā)現(xiàn)其對(duì)慢性SCI療效顯著[3]。前期研究也發(fā)現(xiàn)，火針對(duì)于脊髓神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)和抗凋亡作用[4-5]。但火針是否可能通過影響NSCs的增殖及分化產(chǎn)生作用尚不清楚。本課題應(yīng)用細(xì)胞離體培養(yǎng)和血清藥理學(xué)的方法，就火針干預(yù)SCI大鼠后血清對(duì)脊髓NSCs增殖分化的影響進(jìn)行相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1）孕14 d昆明小鼠2只，清潔級(jí)。2）健康SD大鼠15只，體質(zhì)量250～300 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2007－0001，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組與火針組，每組5只。

1.2 SCI模型動(dòng)物建立 采用改良的Allen’s法[6]建立急性SCI動(dòng)物模型。即采用20 g/L戊巴比妥鈉（40 mg/kg體質(zhì)量）腹腔注射將大鼠麻醉，取后正中切口，切除T9棘突、部分T10棘突和部分椎板，暴露硬膜，10 g的鐵錘從25 mm高處自由落下，撞擊硬膜囊，撞擊能量為25mm×10g，損傷直徑為2.5mm。與脊髓接觸的撞桿底端呈弧狀凹陷，直徑2.5 mm，與脊髓表面相吻合。撞擊成功的標(biāo)志為大鼠尾巴痙攣性擺動(dòng)，雙下肢及身體回縮樣撲動(dòng)，雙下肢呈弛緩性癱瘓。假手術(shù)組只做T9-T10椎板切除術(shù)。術(shù)后小心護(hù)理飼養(yǎng)，每天擠壓排尿3次，直到反射性膀胱排空建立。

1.3 干預(yù)方法 火針組選取大鼠脊髓損傷部位上下端的棘突間隙，相當(dāng)于T7、T8及T11、T12部位，各旁開0.5 cm，共4個(gè)穴，8個(gè)針刺點(diǎn)，采用快針法火針針刺，每穴僅刺1針，深度為3～5 mm。造模后即行針刺1次，之后每隔24 h針刺1次，共治療3次。

1.4 目標(biāo)血清制備 SD大鼠采血前禁食12 h，于第三次針刺后麻醉，無菌條件下腹主動(dòng)脈取血，分離血清。56℃滅活30min，220nm濾膜濾過除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 取孕14 d昆明小鼠，無菌取出胎鼠，經(jīng)D-Hanks液反復(fù)沖洗，解剖鏡下剝離皮膚、肌肉等組織，眼科剪剪碎脊髓，0.25%胰蛋白酶消化，吸管吹打，200目銅網(wǎng)過濾，離心，棄上清，加入含有 DMEM/F12、2%的 B27、20ng/mL堿性成纖維生長因子（bFGF）、20 ng/mL、表皮細(xì)胞生長因子（EGF）、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的生長培養(yǎng)基，以5×105個(gè)/mL密度接種入25cm2培養(yǎng)瓶中，置入37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此后每3 d半量換液1次，每7 d左右傳代1次。傳代培養(yǎng)純化的細(xì)胞經(jīng)Nestin鑒定,顯示Nestin免疫反應(yīng)陽性，表明所培養(yǎng)的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。

1.6 NSCs增殖及生長狀態(tài)觀察 離心收集傳代培養(yǎng)8代的NSCs，吸管機(jī)械吹打,分離制備單細(xì)胞懸液,顯微鏡下計(jì)數(shù)。將細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板,接種密度為 2×105個(gè)/mL。

各組NSCs按培養(yǎng)基中所含血清成分的不同共分3組，即假手術(shù)組、模型組及火針組。各組培養(yǎng)基均為含10%濃度SD大鼠不同血清成分的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不含B27、rhEGF和rhbFGF），每4孔為同一血清成分培養(yǎng)液。

培養(yǎng)7 d后，擬分孔收集呈球形懸浮生長的細(xì)胞，再次機(jī)械分離制備單細(xì)胞懸液，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 NSCs誘導(dǎo)分化觀察 離心收集傳代培養(yǎng)8代呈球形懸浮生長的NSCs，吸管機(jī)械吹打分離成約含十幾個(gè)細(xì)胞的干細(xì)胞小球，分別接種于預(yù)先鋪有多聚賴氨酸蓋玻片的12孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基分別為上述3組含10%不同血清成分的培養(yǎng)基，每4孔為同一血清成分培養(yǎng)液，誘導(dǎo)NSCs分化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 免疫熒光染色 細(xì)胞貼壁培養(yǎng)7 d后，取各組蓋玻片上的細(xì)胞，經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗后，4%多聚甲醛固定30 min，后接常規(guī)免疫熒光染色步驟。以β-tubllin標(biāo)記分化的神經(jīng)元，4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）標(biāo)記細(xì)胞核，每張玻片采用雙盲法選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)神經(jīng)元的比例。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS18.0軟件，進(jìn)行單因素方差分析，兩兩間均值比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組NSCs增殖及生長情況 在相差顯微鏡下，細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板后，第1天，模型組細(xì)胞死亡較多，假手術(shù)組和火針組無明顯變化，細(xì)胞死亡尚少。各組形成了懸浮的、數(shù)量不等、大小不一的細(xì)胞團(tuán)。3 d后，各組細(xì)胞多數(shù)呈球形且開始貼壁，并發(fā)出細(xì)小的突起。3組中，火針組細(xì)胞最多，開始貼壁時(shí)間最早，模型組細(xì)胞數(shù)最少，貼壁出現(xiàn)最晚。

2.2 各組NSCs分化情況 各組神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化情況見表1和圖1。從表1可看出，3組NSCs均出現(xiàn)神經(jīng)元分化，與模型組及假手術(shù)組相比，火針組神經(jīng)元比例顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)7 d后各組NSC分化為神經(jīng)元的比例（±s）Tab.1 The proportion of NSC differentiated neuron after neural stem cells cultured 7 days（±s）%

表1 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)7 d后各組NSC分化為神經(jīng)元的比例（±s）Tab.1 The proportion of NSC differentiated neuron after neural stem cells cultured 7 days（±s）%

注：經(jīng)多因素方差分析，與模型組相比，▲P＜0.05。

組別 n 神經(jīng)元比例假手術(shù)組 5 25.28±1.03模型組 5 14.43±0.85火針組 5 28.22±1.21▲

圖1 不同血清作用7 d后，神經(jīng)干細(xì)胞分化情況Fig.1 The differentiation of neural stem cells affected by the different blood serum after 7 days

3 討論

NSCs為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的原始細(xì)胞，具有自我更新和多潛能分化的特性，可以分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞[7-8]。自1992年Renyolds等[9]從成年小鼠紋狀體分離得到能在體外不斷增殖且可多向分化的NSCs，為中樞系統(tǒng)神經(jīng)損傷的治療提供了新思路。

SCI的病理過程分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，其中神經(jīng)細(xì)胞的病理性凋亡是繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)[10]，故適當(dāng)誘導(dǎo)NSCs增殖并向神經(jīng)元分化以彌補(bǔ)其損失，將成為SCI的潛在治療方法。

課題組在前期研究中證實(shí)，火針能減少SCI大鼠白介素-1β（IL-1β）、Caspase-3、p38MAPK 等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)[10]，抑制凋亡細(xì)胞發(fā)生[11]，表明火針能抑制SCI大鼠炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。那么火針在抑制SCI大鼠細(xì)胞凋亡的同時(shí)，能否通過誘導(dǎo)NSCs增殖并向神經(jīng)元分化以彌補(bǔ)凋亡的神經(jīng)細(xì)胞，從而治療SCI？為探討此問題，課題組設(shè)計(jì)實(shí)施了本次研究。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，火針干預(yù)后的SCI大鼠血清可促進(jìn)離體狀態(tài)下的NSCs增殖，與假手術(shù)組及模型組相比細(xì)胞數(shù)目明顯增多；從神經(jīng)元分化角度，火針組神經(jīng)元分化比例增高，與另兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明火針干預(yù)后的SCI大鼠血清可促進(jìn)NSCs增殖并可誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化，這為火針治療SCI提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)僅為離體細(xì)胞培養(yǎng)，火針能否對(duì)SCI大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖及向神經(jīng)元分化產(chǎn)生作用及其作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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