體外循環(huán)犬單肺缺血再灌注損傷模型的建立

游 露，陳 松，王 勇，李姍姍，竇雪嬌，張 紅

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義563099)

體外循環(huán)犬單肺缺血再灌注損傷模型的建立

游 露，陳 松，王 勇，李姍姍，竇雪嬌，張 紅

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義563099)

目的建立體外循環(huán)單肺缺血再灌注損傷動物模型。方法6只健康雜種犬阻斷左肺動脈，終止左肺血供及通氣，造成左肺缺血，并循體外循環(huán)60 min后開放左肺動脈，恢復(fù)左肺血供及通氣形成再灌注損傷，左肺再灌注2.5 h后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，右肺全程維持血供及通氣。于CPB前(T1)、阻斷左肺動脈并循60 min(T2)、再灌注2.5 h(T3)三個時間點(diǎn)觀察肺組織病理學(xué)變化并進(jìn)行評分，對比肺動態(tài)順應(yīng)性(CD)、氧和指數(shù)(OI)、呼吸指數(shù)(RI)變化比例。結(jié)果①病理學(xué)變化：CPB后左、右肺組織見大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增寬，肺泡壁斷裂甚至壞死；左肺病理改變較右肺嚴(yán)重；②病理切片評分：CPB后左、右肺病理評分逐漸升高；T1時點(diǎn)左、右肺組織評分無差異，T2、T3時點(diǎn)左肺評分明顯高于右肺；③CD、OI、RI變化比例：CPB后CD、OI明顯下降，RI明顯升高；左肺CD、OI下降程度、RI升高程度較右肺明顯。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)動物模型建立成功，能全面地模擬臨床心臟手術(shù)過程，對CPB肺保護(hù)相關(guān)研究有著積極的推動作用。

體外循環(huán)；單肺缺血再灌注損傷；動物模型；犬

肺保護(hù)一直是體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)心臟外科手術(shù)研究的熱點(diǎn)，臨床研究的風(fēng)險性較高，多數(shù)研究的實(shí)施依賴于動物模型。因此，簡單、易行的動物模型對CPB肺保護(hù)的研究有著重要的意義。傳統(tǒng)的心臟停跳模型[1-2]，因心臟停跳往往對動物損傷較大，多數(shù)動物(尤其是小動物)不能耐受，影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步實(shí)施，遠(yuǎn)期肺損傷得不到研究；心臟不停跳模型[3-4]，雖然提高了動物的耐受性，但僅能模擬體外非生理循環(huán)狀態(tài)，不能體現(xiàn)缺血再灌注損傷。為此，本實(shí)驗(yàn)的目的是建立既能模擬體外心臟手術(shù)過程又能提高動物耐受性，在心臟不停跳的基礎(chǔ)上建立單肺(左肺)缺血再灌注損傷模型，為體外循環(huán)肺保護(hù)提供新的研究手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 健康成年雜種犬6只，體重10～15 kg，雌雄不拘，由遵義醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。動物用2.5%戊巴比妥25 mg/kg，腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺，行雙腔氣管插管(根據(jù)需要實(shí)施單側(cè)通氣)，監(jiān)護(hù)ECG、測舌粘膜氧飽和度(SmO2)等，分別于右側(cè)股動、靜脈置管監(jiān)測動態(tài)平均動脈壓(MAP)及中心靜脈壓(CVP)，測量直腸溫度，術(shù)中間斷給予戊巴比妥鈉維持麻醉。用羥乙基淀粉300 mL及乳酸鈉林格氏液100 mL充CPB管道，排氣后備用。

1.2 手術(shù)操作 開胸前，給肌松藥，調(diào)節(jié)呼吸機(jī)潮氣量12～15 mL/kg，呼吸頻率16次/min，I:E=1:2，F(xiàn)iO2=99%，接麻醉機(jī)行機(jī)械通氣。正中劈開胸骨，操作時避開大血管，進(jìn)入胸腔后切開心包暴露心臟；游離左側(cè)肺動脈及右側(cè)肺動脈，分離右側(cè)動脈時，由于犬的右肺動脈位置較深，需要將心臟整個翻起，操作時盡量輕柔、快速，避免損傷，若出現(xiàn)循環(huán)不穩(wěn)定，停止操作，待犬循環(huán)穩(wěn)定后進(jìn)行下一步操作。右心房內(nèi)注入肝素3 mg/kg，肝素化后分別行升主動脈和右心房插管，連接人工心肺機(jī)及CPB管道；待ACT>480 s后開始CPB開始轉(zhuǎn)流，阻斷左肺動脈，調(diào)整雙腔氣管導(dǎo)管行右側(cè)單肺通氣(以直視左側(cè)肺部完全塌陷，右肺單肺通氣為標(biāo)準(zhǔn))，并行循環(huán)60 min后開放左肺動脈，恢復(fù)左肺血液灌注及機(jī)械通氣，30 min內(nèi)逐漸停止CPB，停機(jī)時用魚精蛋白(1∶1.5)中和肝素，機(jī)血回收后回輸入犬體內(nèi)，再灌注2.5 h后實(shí)驗(yàn)結(jié)束。術(shù)中根據(jù)情況適當(dāng)應(yīng)用腎上腺素或硝普鈉股靜脈泵入，維持循環(huán)的穩(wěn)定。在此過程中，通過動脈血?dú)夥治鰜碚{(diào)整酸堿及電解質(zhì)平衡。實(shí)驗(yàn)犬均采用淺低溫CPB，維持MAP在60～80 mmHg，CVP在5～12 cmH2O，灌注流量在100～120 mL/kg/min。

1.3 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測

1.3.1 病理學(xué)變化 分別于CPB前(T1)、阻斷左肺動脈并循60 min(T2)、再灌注2.5 h后(T3)各時點(diǎn)取左、右肺組織，T1時點(diǎn)取上葉肺尖，T2時點(diǎn)取中葉肺尖，T3時點(diǎn)取下葉肺尖，約為1 cm×1 cm，用10%福爾馬林固定，石蠟切片(5 μm)，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.3.2 病理切片評分 根據(jù)改良的Mayer等[5-6]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理評分，每張病理切片隨機(jī)選擇3個高倍鏡視野分別進(jìn)行評分，取平均值作為此切片的評分。

1.3.3 肺功能變化比例 于體外循環(huán)轉(zhuǎn)機(jī)前，短暫阻斷一側(cè)肺動脈，并調(diào)整潮氣量行對側(cè)單肺通氣，使循環(huán)血流及機(jī)械通氣量完全通過單側(cè)肺動脈及支氣管，分別獲得左、右肺功能指標(biāo)的基礎(chǔ)值：①肺動態(tài)肺順應(yīng)性(pulmonary dynamic compliance，CD)，CD= V/P，V=潮氣量，P=氣道峰壓-呼氣末正壓，測量時動物充分鎮(zhèn)靜；②氧合指數(shù)(oxygenation index，OI)，OI=PaO2/ FiO2。T1、T3時點(diǎn)取股動脈血1 mL，行動脈血?dú)夥治?T2時點(diǎn)左肺無血供及通氣，故無血?dú)夥治?檢測血氧分壓(PaO2)，PaO2與吸入氧濃度(FiO2)之比即為血氧和指數(shù)；③呼吸指數(shù)(respiration index，RI) ，RI=P(A-a)O2/ PaO2，P(A-a)O2(肺泡-動脈血氧分壓差)= (Pa-PH2O)FiO2-PaO2-PaCO2，P為大氣壓，標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下為760 mmHg，PH2O為飽和水蒸氣壓，標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下為47 mmHg，F(xiàn)iO2(%)為99%的吸入氧濃度。

左肺再灌注2.5 h后，根據(jù)上述方法，分別測定左、右肺CD 、OI 、RI。計算相應(yīng)左、右肺功能的變化比例= (再灌注后值-基礎(chǔ)值) /基礎(chǔ)值。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)動物體重、體表面積、前并循時間、左肺動脈阻斷時間、后并循時間、CPB時間、灌注液體積以及最低鼻咽溫等比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 肺組織病理變化 T1時點(diǎn)各組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺組織結(jié)構(gòu)正常。T2時點(diǎn)：右肺肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)少量水腫液及較多炎性細(xì)胞浸潤；左肺組織結(jié)構(gòu)均紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)見大量水腫液(見圖1)。T3時點(diǎn)：右肺肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺間質(zhì)見大量水腫液及炎性細(xì)胞；左肺病理損傷較右肺嚴(yán)重，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺間隔明顯增寬，肺間質(zhì)見大量水腫液，肺泡壁斷裂，肺泡腔塌陷，甚至可見部分肺泡壁壞死斷裂，紅細(xì)胞漏出(見圖3)。

注：A：右肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)少量水腫液及炎性細(xì)胞浸潤；B：左肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，部分肺泡腔塌陷，肺泡內(nèi)及間質(zhì)出現(xiàn)水腫液及大量炎性細(xì)胞浸。 圖1 T2時點(diǎn)肺組織HE染色×400

注：C:右肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔塌陷，肺泡腔內(nèi)見大量滲出液及炎性細(xì)胞;D:左肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，大量肺泡腔塌陷，肺泡壁壞死斷裂，肺泡內(nèi)見大量水腫液和炎性細(xì)胞，紅細(xì)胞浸潤。 圖2 T3時刻肺組織HE染色×400

2.3 肺組織病理切片評分 CPB前左、右肺組織無明顯差異(P>0.05)；CPB后左、右肺各時點(diǎn)較CPB前評分逐漸升高(P<0.05)；T2、T3時點(diǎn)左肺病理評分明顯高于右肺(P<0.05，見表1)。

肺組織T1T2T3左肺0.24±0.073.73±0.30*6.03±0.22*#右肺0.21±0.073.27±0.24*△4.55±0.35*#△

注：與T1比較，*P<0.05 ；與T2比較，#P<0.05；與左肺比較，△P<0.05。

2.4 左、右肺肺功能的變化比例 利用血?dú)饨Y(jié)果計算CD、OI 、RI及相應(yīng)肺功能變化比例。再灌注2.5h后，左、右肺功能與基礎(chǔ)值比較均有不同程度的惡化。左肺CD、OI下降程度及RI增加程度比右肺明顯增加(P<0.05,見表2)。

肺組織CD減少比例OI減少比例RI增加比例左肺0.71±0.060.80±0.0516.53±7.74右肺0.43±0.02*0.66±0.07*7.33±5.10*

注:與左肺比較，*P<0.05。

3 討論

CPB期間血液成分與人工管道的接觸、中性粒細(xì)胞的釋放與聚集、內(nèi)毒素的釋放等均可引起機(jī)體復(fù)雜的炎癥反應(yīng)，這種炎癥反應(yīng)是引發(fā)全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的重要原因；肺循環(huán)及呼吸機(jī)停止，使肺組織處于缺血、缺氧狀態(tài)，造成肺缺血性損害，肺組織細(xì)胞骨架及線粒體破壞嚴(yán)重；當(dāng)開放肺動脈后，大量血液及氧氣進(jìn)入肺循環(huán)造成肺再灌注損傷，導(dǎo)致肺功能嚴(yán)重下降[7-8]?？梢姡硐到y(tǒng)性炎癥反應(yīng)及缺血再灌注損傷是導(dǎo)致CPB肺損傷的兩大主要因素。

根據(jù)體外循環(huán)肺損傷的特點(diǎn)建立CPB單肺(左肺)缺血再灌注損傷模型，在全程轉(zhuǎn)機(jī)的同時阻斷左肺動脈，模擬臨床心臟直視手術(shù)阻斷升主動脈心臟停跳過程中肺組織的缺血狀態(tài)；開放左肺動脈模擬CPB心臟復(fù)跳后肺組織再灌注損傷。與臨床實(shí)際操作不同，實(shí)驗(yàn)動物心臟并不停跳，減少了動物的創(chuàng)傷，使實(shí)驗(yàn)動物能夠長時間的保持循環(huán)穩(wěn)定(左肺再灌注后能維持生命體征平穩(wěn)超過2.5 h)。心臟不停跳的情況下全程并行循環(huán)，排出心臟因缺血再灌注對肺功能的干擾。在既有的CPB單肺肺損傷模型[9]基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，簡化了分離左肺靜脈，減少了操作步驟，更簡單易行，提高了實(shí)驗(yàn)的成功率。為了平衡左、右肺的差異，分別測量左、右肺基礎(chǔ)值(選擇體外循環(huán)建管之后，轉(zhuǎn)流之前的測量值為肺功能基礎(chǔ)值)，通過對比再灌注后2.5 h左、右肺功能的變化的比例，來代替實(shí)測值判斷雙側(cè)肺功能損傷的程度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CPB前左、右肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔無明顯增寬，肺泡腔未見填充物；CPB后左、右肺組織損傷逐漸加重，出現(xiàn)肺泡間隔增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)及肺間質(zhì)見大量水腫液；同時肺組織病理切片評分也逐漸升高；再灌注2.5 h后，左肺較右肺肺組織損傷更嚴(yán)重；左肺比右肺同時點(diǎn)病理評分明顯增高(P<0.05)。說明：CPB可導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)的病理改變；左肺由于遭受全身炎癥反應(yīng)與缺血再灌注的雙重打擊，與右肺比較，左肺損傷更嚴(yán)重。提示，左肺缺血再灌注損傷建立成功。

CD、OI、RI是公認(rèn)的反應(yīng)肺功能的指標(biāo)[10]，通過對比CD、OI、RI肺功能變化比例來判斷肺功能損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與基礎(chǔ)值相比左、右肺功能均有不同程度的惡化；與右肺比較，左肺CD、OI、RI的惡化程度均明顯增加(P<0.05)，左肺肺損傷程度明顯重于右肺。說明：左肺在非生理性循環(huán)的基礎(chǔ)上，又遭受了缺血再灌注損傷，使肺功能進(jìn)一步惡化。

綜上所述，CPB單肺缺血再灌注損傷模型建立成功，實(shí)驗(yàn)犬左肺能夠同時反映CPB非生理循環(huán)及缺血再灌注的雙重打擊，充分模擬臨床心臟手術(shù)過程。本模型適用于體外循環(huán)肺損傷及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究，有助于體外循環(huán)肺保護(hù)的發(fā)展。

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Establishmentofdoglungischemia-reperfusioninjuryofcardiopulmonarybypassmodel

Youlu,Chensong,Wangyong,Lishanshan,Douxuejiao,Zhanghong

(Department of Anesthesiology,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo establish a single lung ischemia-reperfusion injury of cardiopulmonary bypass (CPB) animal model in dog.MethodsSix healthy mongrel dogs was established the CPB mode, at the same time, the left pulmonary artery was clamping on; termination of the left lung blood supply and ventilation cause left lung ischemia,and left pulmonary artery was opened at 60 minutes. Restore left lung blood supply and ventilation formed reperfusion injury. The experiment was finished after reperfusion 2.5 h. Before CPB (T1), blocking the left pulmonary artery and through 60 min (T2), reperfusion 2.5 h (T3) three time points pathological changes of lung tissue and score Compare with left and right lung function change of pulmonary dynamic compliance (CD), and oxygen index (OI), respiratory index (RI) after reperfusion 2.5 h.Results①After CPB,left and right lung pathological structures was deteriorated to varying degrees; the left lung tissue structural disorder , alveolar wall rupture and necrosis , inflammatory cells and red blood cell was leakage , pathological damage was severe than the right lung after reperfusion 2.5 h.②Pathological section score of lung tissue: After CPB , compared with CPB before the scores gradually increased at each time point; the left lung score was significantly higher than the right lung in reperfusion 2.5 h.③The deterioration of the left lung of CD,OI,RI was significantly increased than the rigt lung after reperfusion 2.5h.ConclusionThe experimental animal model was successfully established, and comprehensively simulate lung injury factors in the process of clinical cardiopulmonary bypass . CPB lung protection related research was promoted.

Cardiopulmonary bypass; ischemia-reperfusion injury of lung; animal model; dog

貴州省科技廳聯(lián)合基金資金資助(NO:黔科合J字LKZ[2012]05)。

張紅,女,教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向:體外循環(huán)肺保護(hù)，E-mail:hianzhang@tom.com。

R332

A

1000-2715(2013)05-0437-04

[收稿2013-05-21;修回2013-09-13]

(編輯：譚秀榮)