鼻咽癌組織中EBERs與BMI-1表達(dá)相關(guān)性研究

王 聚,鄒 彥,湯 明

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，貴州 遵義 563099；2. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院 頭頸腫瘤科，貴州 遵義 563099)

鼻咽癌組織中EBERs與BMI-1表達(dá)相關(guān)性研究

王 聚1,鄒 彥2,湯 明2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，貴州 遵義 563099；2. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院 頭頸腫瘤科，貴州 遵義 563099)

目的探討鼻咽癌組織中EBERs與BMI-1表達(dá)相關(guān)性。方法對(duì)2007年12月至2009年11月收治的40例鼻咽癌患者的石蠟包埋切片進(jìn)行研究：原位雜交方法檢測(cè)這些切片中EBERs的表達(dá)；免疫組化方法檢測(cè)這些切片中BMI-1的表達(dá)。結(jié)果40例鼻咽癌組織中EBERs情況：高表達(dá)組為11例，低表達(dá)組為29例，合計(jì)陽(yáng)性表達(dá)率為100%(40/40)。40例鼻咽癌組織中BMI-1情況：BMI-1陽(yáng)性表達(dá)率為32.5%(13/40)。鼻咽癌組織中EBERs表達(dá)與BMI-1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。結(jié)論鼻咽癌中EBERs表達(dá)與BMI-1表達(dá)無(wú)相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究，并探討二者在鼻咽癌中的機(jī)理。

鼻咽癌；EBERS；BMI-1

我國(guó)是鼻咽癌高發(fā)區(qū),發(fā)病的確切原因尚不清楚,一般認(rèn)為與EBV (epstein-barr virus ,EB病毒) 感染密切相關(guān)；在感染人體后長(zhǎng)期潛伏,可表達(dá)多種基因,其潛伏膜蛋白(LMP)編碼基因、EB病毒核抗原(EBNA)基因及EBV編碼的小RNA(EBER)；其可能不同程度存在于鼻咽癌組織中并可能通過(guò)不同的機(jī)制導(dǎo)致鼻咽癌。在鼻咽癌中，層粘連蛋白、白細(xì)胞介素和潛伏膜蛋白-1一起上調(diào)

BMI-1的表達(dá)[1]。關(guān)于鼻咽癌中EBERs和BMI-1表達(dá)相關(guān)性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此我們對(duì)2007年12月至2009年11月收治的40例鼻咽癌患者的組織切片進(jìn)行研究,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 收集我院2007年12月至2009年11月40例經(jīng)病理確診鼻咽癌的病理組織蠟塊，其中男性29例，女性11例，年齡30～77歲，中位年齡45歲，病理類(lèi)型均為非角化型癌分化型。

1.2 試驗(yàn)方法 將上述病理組織蠟塊，連續(xù)4 μm 切片備用,平鋪于涂有多聚賴氨酸(1 mg/m1)的玻片上,行HE染色、EBERS原位雜交、BMI-1的EnVision二步免疫組化染色。EBERS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Dako公司，為DakoCytomation EBV(EVER) probe，具體實(shí)驗(yàn)步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,用試劑盒所帶陰性控制試劑做陰性對(duì)照，用已知EBERs陽(yáng)性的鼻咽癌組織切片做陽(yáng)性對(duì)照。BMI-1檢測(cè)中鼠抗人BMI-1單克隆抗體購(gòu)自R&D公司，EnVisionTM免疫組化試劑盒購(gòu)自Gene Tech公司，具體染色方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，陰性對(duì)照以TBS取代一抗,用已知BMI-1陽(yáng)性的乳腺癌組織切片做陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果評(píng)價(jià)

1.3.1 EBERS結(jié)果評(píng)價(jià) 應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡，高倍鏡下(10×20)隨機(jī)取4個(gè)不同的視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及核陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，按陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比積分。

EBERs陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞核，呈紫黑色，表達(dá)信號(hào)強(qiáng)度分五級(jí)：(-)陰性；(+)<24%癌細(xì)胞陽(yáng)性；(++)25%～49%癌細(xì)胞陽(yáng)性；(+++)50%～74%癌細(xì)胞陽(yáng)性；(++++)>75%癌細(xì)胞陽(yáng)性。根據(jù)鼻咽癌組織中EBERs的表達(dá)情況分為陰性組、低表達(dá)組(+、++)和高表達(dá)組(+++、++++)。

1.3.2 BMI-1結(jié)果評(píng)價(jià) 應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡，高倍鏡下(10×20)隨機(jī)取4個(gè)不同的視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及核陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，按陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比積分。同時(shí)，根據(jù)染色的強(qiáng)弱程度也計(jì)分。

BMI-1陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈黃色、棕黃色。陽(yáng)性細(xì)胞率≤10%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞率>10%且≤50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞率>50%且≤75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞率>75%為4分；同時(shí)，根據(jù)染色的強(qiáng)弱程度也計(jì)分：陰性1分，弱染色2分，中等強(qiáng)度染色3分，強(qiáng)染色4分。通過(guò)二者的乘積來(lái)判斷結(jié)果：≤4分為(-)；>4分且≤8分為(+)；>8分且≤12分為(++)；>12分且≤16分為(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，相關(guān)性分析選擇Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 40例鼻咽癌組織中EBERs情況 (+)組14例、(++)組15例、(+++)組7例、(++++)組4例；合計(jì)低表達(dá)組為29例，高表達(dá)組為11例，陽(yáng)性表達(dá)率為100%(40/40)。

2.2 40例鼻咽癌組織中BMI-1情況 BMI-1表達(dá)陰性組27例，(+)組2例，(++)組8例，(+++)組3例，陽(yáng)性表達(dá)率為32.5%(13/40)。

2.3 鼻咽癌組織中EBERs 表達(dá)與BMI-1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05(見(jiàn)表1)。

表1鼻咽癌組織中EBERs表達(dá)與BMI-1表達(dá)統(tǒng)計(jì)表

組別BMI-1(-)BMI-1(+)BMI-1(++)BMI-1(+++)合計(jì)EBERs低表達(dá)組2215129EBERs高表達(dá)組513211合計(jì)2728340

注：P>0.05。

2.4 HE染色光鏡觀察結(jié)果(見(jiàn)圖1)。

2.5 鼻咽癌組織中EBERs陽(yáng)性表達(dá)光鏡觀察結(jié)果(見(jiàn)圖2)。

2.6 鼻咽癌組織中BMI-1的陽(yáng)性表達(dá)光鏡觀察結(jié)果(見(jiàn)圖3)。

3 討論

EBV是一種嗜B淋巴細(xì)胞的人類(lèi)皰疹病毒,為雙鏈DNA病毒，是比較明確的DNA腫瘤病毒,在全球廣泛分布，感染人群后通常在人體內(nèi)終身潛伏。Ⅰ～Ⅲ型EBV潛伏感染均可合成EB 病毒轉(zhuǎn)錄的核內(nèi)小RNA ( EBV encoded small RNAs ,EBERs)。文獻(xiàn)報(bào)道[2]用原位雜交方法在鼻咽粘膜慢性炎中未檢測(cè)到EBERs，在鼻咽癌組織中EBERs陽(yáng)性表達(dá)率100%(53/53)。本文對(duì)40例鼻咽癌組織中EBERs表達(dá)進(jìn)行研究，陽(yáng)性表達(dá)率結(jié)果也為100%(40/40)，再次證明鼻咽癌組織中EBERs表達(dá)非常高，且用原位雜交的方法檢測(cè)鼻咽癌中EBERs表達(dá)方法簡(jiǎn)單、技術(shù)成熟，可以作為檢測(cè)組織細(xì)胞EBV感染的一種方法。本文報(bào)道的40例鼻咽癌組織中EBERs表達(dá)陽(yáng)性表達(dá)程度不一致，分析其原因可能與以下因素有關(guān)：1、選取的鼻咽癌組織中本身EBERs拷貝數(shù)不同；2、由于選用的研究標(biāo)本是既往確診鼻咽癌的病理組織蠟塊，在組織固定或保存過(guò)程中可能存在EBERs的分解。但是通過(guò)本文研究，用原位雜交的方法檢測(cè)鼻咽癌中EBERs表達(dá)至少在分化型非角化型鼻咽癌中是一種高敏感性的方法。

宋立兵等[3]報(bào)道在鼻咽癌組織中BMI-1蛋白高表達(dá)率為38.7%(29/75)。我們研究的BMI-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為32.5%(13/40)，高表達(dá)率為11.1%(3/40)。二者高表達(dá)率的不同，分析可能與研究的標(biāo)本不同有關(guān)。近年研究表明[4]BMI-1蛋白在腫瘤組織中表達(dá)差異，主要與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。

在鼻咽癌發(fā)生過(guò)程中EB病毒可能在誘導(dǎo)基因突變中起作用,導(dǎo)致癌基因的激活,或破壞抑癌基因,并導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力降低,最終形成腫瘤。在鼻咽癌中，層粘連蛋白、白細(xì)胞介素和潛伏膜蛋白-1一起上調(diào)BMI-1的表達(dá)[1]。但是本文研究得出鼻咽癌中EBERs表達(dá)與BMI-1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，二者間不存在相關(guān)性。EBERs由于缺乏3′端多聚腺苷，不編碼蛋白質(zhì)[5]，不能直接發(fā)揮生物功能，導(dǎo)致腫瘤的形成。通過(guò)本文研究在鼻咽癌組織中EBERs表達(dá)與BMI-1表達(dá)無(wú)關(guān)，因而EBERs表達(dá)后不會(huì)上調(diào)BMI-1的表達(dá)。鼻咽癌組織中EBERs表達(dá)與腫瘤形成有何關(guān)系有待研究。但是本文研究得出在鼻咽癌組織中BMI-1有一定的表達(dá)；其它研究也表明與正常鼻咽上皮細(xì)胞相比較，BMI-1在鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)[3]。說(shuō)明在鼻咽癌腫瘤形成過(guò)程中BMI-1會(huì)表達(dá)并起到一定作用，同時(shí)本文研究在鼻咽癌組織中BMI-1表達(dá)與EBERs表達(dá)無(wú)關(guān)，因而何種機(jī)制促進(jìn)BMI-1的表達(dá)有待進(jìn)一步研究。但是BMI-1一旦被激活可高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中, 其發(fā)揮作用的途徑是控制下游的癌蛋白以及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白, 如c-myc、pRB等的激活，在細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)節(jié)作用，能保持靶基因特異的穩(wěn)定抑制狀態(tài)，可能從細(xì)胞凋亡障礙、細(xì)胞增殖失控方面引起惡性腫瘤細(xì)胞的增生。

本研究得出用原位雜交的方法檢測(cè)鼻咽癌組織中EBERs表達(dá)在分化性非角化型鼻咽癌中是一種高敏感性的方法。并且得出分化型非角化型鼻咽癌中EBERs表達(dá)與BMI-1表達(dá)關(guān)系無(wú)相關(guān)性。鼻咽癌組織中EBERs表達(dá)與腫瘤形成有何關(guān)系，何種機(jī)制促進(jìn)BMI-1的表達(dá)，有待今后進(jìn)一步進(jìn)行研究；并探尋二者在鼻咽癌中的機(jī)理。

[1] Michelle M S Chew,Sook-Yee Gan,Alan SB Khoo,etal,Interleukins, laminin and epstein-barr virus latent membrane protein 1 (EBV LMP1) Promote metastatic phenotype in nasopharyngeal carcinoma[J].BMC Cancer,2010,10: 574.

[2]江慶萍,劉少顏,何秀芳,等. 鼻咽癌中MAP3K5和Epstein-Barr病毒編碼的miR-BART22表達(dá)的關(guān)系及意義[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(7):1146-1149.

[3]宋立兵,廖雯婷,曾木圣,等. 新的腫瘤標(biāo)志物Bmi-1基因誘導(dǎo)正常鼻咽上皮細(xì)胞永生化[C]. 中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集，2006.

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[5]閔華慶. 鼻咽癌研究[M]. 廣州: 廣東科技出版社,1998：57- 75.

ResearchfortheexpressivecorrelationofEBERsandBMI-1innasopharyngealcarcinoma

Wangju1,Zouyan2,Tangming2

(1.Department of Nuclear,The Affiliated Hospital,Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China;2.Department of Head And Neck Oncology,The Oncology Hospital of The Affiliated Hospital,Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo observe the expressive correlation of EBERs (EBV encoded small RNAs) and BMI-1 (B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog)in nasopharyngeal carcinoma (NPC).MethodsWe studied the paraffin-embedded sections of 40 NPC from December 2007 to November 2009. The expression of EBERs were detected by in situ hybridization.The expression of BMI-1were detected by Immunohistochemistry .ResultsOf the 40 cases of NPC, the low expression group was 29 cases,the high expression group was 11 cases,the positive rate of EBERSwas 100% (40/40).Of the 40 cases of NPC, the positive rate of EBERSwas 32.5%(13/40). The expression difference of EBERs and BMI-1was not statistically significant in NPC,P>0.05.ConclusionThe expression of EBERs and BMI-1 in NPC is not correlated . Further researches are needed to elucidate their expression in NPC.

nasopharyngeal carcinoma; EBERs; BMI-1

遵義市科技局分社基金項(xiàng)目(NO:200902)。

鄒彥，女，主任醫(yī)師，研究方向：頭頸部腫瘤，E-mail:zouyan.714@163.com。

R739.63

A

1000-2715(2013)05-0453-03

[收稿2013-08-02;修回2013-09-29]

(編輯：譚秀榮)