西藏紅景天提取物延長線蟲壽命和抗氧化活性探索

肖家軍，陸 媚，馬勝利，李 錦

淮南師范學(xué)院生命科學(xué)系，淮南 232001

紅景天為景天科紅景天屬，多年生草本或亞灌木植物，是珍稀藥食兩用植物之一，有“高原人參”之譽(yù)。該屬全世界有九十多種，我國約七十三種，居世界之首，主要分布在東北、西藏、新疆等地。我國在紅景天的應(yīng)用方面有悠久的歷史:公元1200年的藏醫(yī)《四部醫(yī)典》已有記載，秦漢時(shí)期的《神農(nóng)本草》、李時(shí)珍的《本草綱目》等都有記載，而且衛(wèi)生部1991年批準(zhǔn)紅景天為新食品資源。近十多年的研究證明，紅景天具有提高機(jī)體免疫力、增強(qiáng)體質(zhì)、抗氧化、抗疲勞、以及預(yù)防高原反應(yīng)等多種功能［1］。

紅景天中含有多種化學(xué)成分，其中紅景天苷為迄今研究最多的已知有效成分之一，已經(jīng)成為眾多臨床藥物的主要成分之一［2］。近年來研究也發(fā)現(xiàn)，紅景天苷具有抗輻射、抗缺氧等多種作用。為進(jìn)一步發(fā)掘紅景天的有效成分，我們比較了紅景天粗提物及紅景天苷對(duì)延長秀麗隱桿線蟲壽命的差異，并從體外抗氧化活性的角度對(duì)其可能的機(jī)制作了初步分析。

1 材料與儀器

紅景天苷(重慶寰瑞生物技術(shù)有限公司，純度＞95%)、紅景天(青海雪域源土特產(chǎn)開發(fā)有限公司)、鄰苯三酚(溫州甌海精細(xì)化工有限公司)、30%過氧化氫(宿州化學(xué)試劑廠)、維生素C(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，純度＞98%)，其它試劑均為分析純。

E．coli OP50、野生型秀麗隱桿線蟲(N2)由本系王順昌教授惠贈(zèng)。

RE3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司);UV2300型紫外分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司);LDZX-40BI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);DNP-9022電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海光都儀器設(shè)備有限公司);SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);WD800CTL23-2H型格蘭仕微波爐(廣東佛山格蘭仕微波爐有限公司);FZ102型微型植物粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 紅景天成分的提取及濃度的配制

原料紅景天35度鼓風(fēng)干燥，磨碎，過100目篩，稱取適量紅景天粉，水煮3次，合并水煮液，過濾，濃縮，得到母液為1 g/mL。用三蒸水配制不同濃度的紅景天粗提物溶液、紅景天苷溶液和VC溶液。

NGM(Nematodegrowth medium)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(1L)［3］121 ℃滅菌30 min，滅菌后加入1M CaCl2及1M MgSO4各l mL和25 mL 1M pH 6.0磷酸鉀緩沖液。E．coli OP50接種于含有不同藥物濃度的LB固體培養(yǎng)基中，37℃過夜后，置于4℃?zhèn)溆?。雌雄同體線蟲N2，接種于涂布E．coli OP50，且細(xì)菌生長良好的NGM上，恒溫20℃培養(yǎng)。

2.2 紅景天粗提物、紅景天苷等延長線蟲壽命實(shí)驗(yàn)

秀麗隱桿線蟲壽命實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和含藥組，對(duì)照組不含藥物，用藥組從低到高設(shè)3個(gè)濃度梯度。各組培養(yǎng)基中均含12.5 mg/L5-Fu以抑制線蟲子代的孵育，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［4］，12.5 mg/L 5-Fu不影響線蟲壽命。挑取同步化的L4期線蟲到各組培養(yǎng)基中，每種藥物含30條，每個(gè)濃度板中含有10條，于20℃培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)移時(shí)刻起開始計(jì)算線蟲存活天數(shù)，轉(zhuǎn)移當(dāng)天記為壽命實(shí)驗(yàn)第0天(day0)。隔天檢查線蟲，記錄死亡線蟲數(shù)，剔除逃逸、意外死亡和囊樣線蟲。線蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn):用鉑絲輕觸蟲體，無任何反應(yīng)，即可判斷為死亡。

2.3 紅景天的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 紅景天粗提物溶液、紅景天苷溶液清除DPPH 自由基［5］

取生藥量為1 g/mL的紅景天粗提物溶液進(jìn)行濃度梯度稀釋，分別取出2 mL離心管中，并加入2 mL 0.25 mmol/L的 DPPH溶液，分別標(biāo)記為 A1、A2、A3、A4、A5。暗處靜置 30 min，在 517 nm 處測(cè)光吸收值A(chǔ)i。

再分別從濃度梯度母液取出2 mL于離心管中，并加入2 mL的50%乙醇，分別標(biāo)記為A1’、A2’、A3’、A4’、A5’。暗處靜置 30 min，在 517nm 處測(cè)光吸收值A(chǔ)j。

以2 mL 0.25 mmol/L的DPPH和2 mL 50%乙醇反應(yīng)作參照，暗處靜置30 min，在517 nm處測(cè)吸收值 A0。

由公式:清除率 P%=［1-(Ai-Aj)/A0］×100%，計(jì)算清除DPPH能力。紅景天苷溶液和Vc溶液實(shí)驗(yàn)過程相同。

2.3.2 紅景天粗提物溶液、紅景天苷溶液清除羥基自由基［6］

取生藥量為1 g/mL的紅景天粗提物溶液進(jìn)行梯度稀釋，取有刻度的試管，分別標(biāo)記為 B1、B2、B3、B4、B5。向5 mL離心管中加入0.5 mL的 Fe-SO4溶液，0.5 mL的H2O2溶液，1 mL的水楊酸溶液，1 mL的樣品液，1 mL的三蒸水，然后置于37℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，取出在3000 r/min離心10 min，最后在510 nm波長處測(cè)吸光度值A(chǔ)i。

用三蒸水代替水楊酸，方法和上面相同，在波長510nm處測(cè)吸光值為Aj。

空白對(duì)照組以三蒸水代替母液，其他和上面相同，在波長510nm處測(cè)吸光值為A0。由公式:清除率P%=［1-(Ai-Aj)/A0］×100%，計(jì)算清除羥基自由基能力。紅景天苷溶液和Vc溶液實(shí)驗(yàn)過程相同。

2.3.3 紅景天粗提物溶液、紅景天苷溶液和Vc溶液清除超氧自由基［7］

向10 mL離心管中加入1 mL的三蒸水，4 mL的緩沖液，然后置于25℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)200 min，加入0.1 mL的鄰苯三酚，混勻，再繼續(xù)水浴5 min，最后加入1 mL 8 mol/L的鹽酸，在420 nm波長處測(cè)其吸光度值。

取生藥量為1 g/mL的紅景天粗提物溶液進(jìn)行梯度稀釋，取有刻度的試管，分別標(biāo)上C1、C2、C3、C4、C5，向離心管中加入1 mL的樣品液，4 mL的緩沖液，然后置于25℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)20 min，加入0.1 mL的三蒸水，混勻，再繼續(xù)水浴5 min，最后加入1 mL 8mol/L的鹽酸，在420 nm波長處測(cè)其吸光度值。由公式:清除率P%=［1-(Ai-Aj)/A0］×100%，計(jì)算清除超氧自由基能力。紅景天苷溶液和Vc溶液實(shí)驗(yàn)過程相同。全部抗氧化實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 紅景天粗提物等對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響

圖1 紅景天苷、紅景天粗提物等藥物對(duì)線蟲壽命的影響Fig.1 Effects of extending life span of C．elegans with the extract of Rhodiola tibetica and salidroside

從圖中可以看出，無論是與紅景天苷相比，還是與黃芪粗提物相比，紅景天粗提物在延長秀麗隱桿線蟲壽命方面都顯示了明顯的優(yōu)勢(shì)。在相同條件下，紅景天粗提物相比紅景天苷能夠顯著延長線蟲壽命，提示在紅景天粗提物中可能存在能明顯影響動(dòng)物壽命的物質(zhì)。

3.2 紅景天苷的體外抗氧化活性測(cè)定

圖2 紅景天苷、紅景天粗提物、Vc清除DPPH自由基Fig.2 Scavenging activities of the extracta of R．tibetica，salidroside and Vc on DPPH free radical

3.2.1 各物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖3 紅景天苷、紅景天粗提物、VC清除羥基自由基Fig.3 Scavenging activities of the extracta of R．tibetica，salidroside and Vc on hydroxy radical

由圖可以看出，樣品液隨著濃度的不斷增大，清除DPPH自由基的能力也逐漸增強(qiáng)。借助DPS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得出紅景天苷溶液的EC50(即清除率達(dá)到50%時(shí)所需藥物的濃度為1291.53 μg/mL，而紅景天粗提取物溶液的EC50為489.76 μg/mL，VC的 EC50為 8.75 μg/mL。經(jīng)計(jì)算得出紅景天苷溶液的EC50約是紅景天提取物溶液的2.6倍，約是VC的147.6倍。

3.2.2 各物質(zhì)對(duì)羥基自由基的清除作用

由圖可以看出，樣品液隨著濃度的不斷增大，清除羥基自由基的能力也逐漸增強(qiáng)。借助DPS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得出紅景天苷溶液的EC50所需藥物的濃度為1120.94 μg/mL，而紅景天粗提取物溶液的EC50為1068.37 μg/mL，VC的EC50為579.27 μg/mL。經(jīng)計(jì)算得出紅景天苷溶液的EC50約是紅景天提取物的1.1倍，約是VC的1.94倍。

4 紅景天苷、紅景天粗提物、VC清除超氧陰離子自由基Fig.4 Scavenging activities of the extracta of R．tibetica，salidroside and Vc on superoxide radical

3.2.3 各物質(zhì)對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

由圖可以看出，樣品液隨著濃度的不斷增大，清除超氧陰離子自由基的能力也逐漸增強(qiáng)。借助DPS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得出紅景天苷溶液的EC50(即清除率達(dá)到50%時(shí)所需藥物)的濃度為55.57 μg/mL，而紅景天提取物溶液的EC50為40.49 μg/mL，VC的 EC50為 22.37 μg/mL。經(jīng)計(jì)算得出紅景天苷溶液的EC50約是紅景天提取物溶液的1.4倍，約是VC的2.5倍。

4 討論

人類對(duì)于衰老的研究，已經(jīng)達(dá)到分子水平，眾多的研究［8-10］表明，目前尚未發(fā)現(xiàn)目標(biāo)單一的作用于衰老的基因，在研究的所謂衰老相關(guān)基因多是消除自由基的某些酶類基因，及與細(xì)胞生長調(diào)控有關(guān)的某些因子的基因。自由基對(duì)人體的危害是從對(duì)細(xì)胞和組織的損傷開始，Denham Harman博士 1956年［11］提出自由基衰老學(xué)說，其主要依據(jù)是在正常情況下機(jī)體的自由基的產(chǎn)生與消失處于動(dòng)態(tài)平衡。一旦失去平衡即逐漸趨于老化，最終導(dǎo)致衰老，即生物體的衰老過程是機(jī)體的組織細(xì)胞不斷產(chǎn)生的自由基積累結(jié)果。

紅景天抗氧化活性受到很多學(xué)者的關(guān)注，國內(nèi)學(xué)者大多以小鼠為研究對(duì)象，分析相關(guān)指標(biāo)，探討紅景天的生物活性。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響中，紅景天的主要有效成分紅景天苷影響較小，而紅景天的粗提物表現(xiàn)較大優(yōu)勢(shì)。體外抗氧化結(jié)果表明，與VC相比，紅景天苷具有一定的清除DPPH、羥基自由基、超氧陰離子自由基能力，但抗氧化活性并不高，另一方面，紅景天苷與紅景天粗提物在清除這三種自由基的能力比較中，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，紅景天粗提物清除三種自由基的能力均強(qiáng)于紅景天苷，說明在紅景天中應(yīng)該還存在某種或某類物質(zhì)，其抗氧化活性比紅景天苷要強(qiáng)很多，具體成分還有待進(jìn)一步研究。

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