MALDI-TOF質(zhì)譜法檢測人血清中沙林-丁酰膽堿酯酶加合物

姚 戈，曹 瑛，范崇旭，劉尚義，代先東，溫曉波，陳冀勝

(北京藥物化學研究所，北京 102205)

MALDI-TOF質(zhì)譜法檢測人血清中沙林-丁酰膽堿酯酶加合物

姚 戈，曹 瑛，范崇旭，劉尚義，代先東，溫曉波，陳冀勝

(北京藥物化學研究所，北京 102205)

對生物醫(yī)學樣品進行化學毒劑分析檢測是禁止化學武器組織(OPCW)核查小組在毒劑指稱使用調(diào)查中收集事實的方法之一。丁酰膽堿酯酶(BChE)作為有機磷毒劑在體內(nèi)的作用靶點，是有機磷毒劑染毒檢測的最佳生物指示物之一。利用親和固相萃取(SPE)技術進一步發(fā)展了樣品預處理方法，建立了血液樣品中染毒BChE的分析方法；利用胰蛋白酶酶解方法，采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)比較了血液中BChE在沙林染毒前后的肽指紋譜變化。該方法靈敏度高、快速簡便，可用于OPCW生物醫(yī)學樣品中毒劑暴露染毒的追溯性檢測。

生物醫(yī)學樣品；有機磷毒劑；丁酰膽堿酯酶；基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)

有機磷毒劑是禁止化學武器組織(OPCW)宣布的毒性最強的致死性化學戰(zhàn)劑，已被證實曾在兩伊戰(zhàn)爭及日本東京地鐵恐怖襲擊事件中使用[1-2]。OPCW一直將該類毒劑作為化學武器核查的重點對象之一，目前已經(jīng)建立了標準的樣品處理及分析方法，但多適用于環(huán)境化學樣品(土樣、水樣等)的分析。相較于環(huán)境樣品，針對生物基質(zhì)樣品(尿樣、血樣等，亦稱生物醫(yī)學樣品)中有機磷毒劑的分析檢測則具有更強的溯源性。因此，近年來OPCW開始注重對該類樣品分析方法的研究[3]。

有機磷毒劑在體內(nèi)的作用靶點主要為乙酰膽堿酯酶(AChE)與丁酰膽堿酯酶(BChE)，是膽堿酯酶不可逆抑制劑。由于血液中BChE含量遠高于AChE，因此在血液樣品中，BChE可以看作是有機磷毒劑染毒檢測的最佳生物指示物之一[4]。BChE作為有機磷毒劑的生物作用靶點，具有敏感性高、形成加合物半衰期長的特點(8～15天)[5]。目前對BChE加合物的分析多采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)或基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)[6-8]。但由于在血液中BChE含量較低(約80 nmol)[5]，許多豐度較高的蛋白質(zhì)(如血清白蛋白、免疫球蛋白)會對BChE的檢測產(chǎn)生很大影響。因此在生物醫(yī)學樣品分析中高效的樣品預處理技術是分析檢測過程的重要因素。

本工作擬以標志性有機磷毒劑沙林為代表，建立沙林-BChE加合物的分析檢測方法。并利用BChE與鹽酸普魯卡因酰胺間的親和特性，結(jié)合固相萃取(SPE)技術，建立快速的樣品預處理過程，實現(xiàn)對微量血樣中沙林-BChE加合物的快速檢測，為OPCW生物醫(yī)學樣品有機磷毒劑追溯性檢測提供分析方法。

1 試驗部分

1.1儀器與試劑

UltraFlex II型 MALDI串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Bruker Daltonics公司產(chǎn)品；YM10 超濾管：美國Milipore公司產(chǎn)品；KTA prime液相層析儀：美國Amersham Bioscience公司產(chǎn)品；PowerPac 300 電泳儀：美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；ALPHA 2-4 Christ冷凍干燥機：德國Martin Christ公司產(chǎn)品。

1.2主要材料與試劑

人血清：購自北京市紅十字會血液中心；沙林，維?？怂?VX)，梭曼:由國家履約實驗室饋贈；鹽酸普魯卡因酰胺：美國Aldrich公司產(chǎn)品；溴化氰活化Sepharose 4B：美國Amersham Bioscience公司產(chǎn)品；胰蛋白酶(測序級)：美國Roche公司產(chǎn)品；α-氰基-4-羥基肉桂酸(CCA)：美國Bruker Daltonics公司產(chǎn)品；硫酸銨(分析純)：北京化學試劑公司產(chǎn)品；其他化學試劑均為分析純。

1.3試驗方法

1.3.1普魯卡因酰胺-Sepharose 4B親和凝膠的制備 普魯卡因酰胺與Sepharose 4B的偶聯(lián)按文獻[9]進行：溴化氰活化的Sepharose 4B凍干粉用1 mmol鹽酸溶脹沖洗，充分溶脹的凝膠轉(zhuǎn)移至含有ε-氨基己酸的偶聯(lián)緩沖液中，于4 ℃攪拌混勻48 h。已偶聯(lián)的ε-氨基己酸凝膠懸浮于水中，加入鹽酸普魯卡因酰胺至濃度100 mmol/L，然后加入偶聯(lián)劑EDC，持續(xù)攪拌混勻24 h(pH 4.5)。未結(jié)合的普魯卡因酰胺用去離子水洗凈，制備好的凝膠用50 mmol 聚丁二酸丁二醇酯(PBS)(pH 8.0)懸浮，置于4 ℃保存。

1.3.2人血清中BChE的分離純化 10 mL人血清經(jīng)硫酸銨分級沉淀后，所得上清液用去離子水透析12 h。取制備好的普魯卡因酰胺-Sepharose 4B親和凝膠裝柱，上樣后先用緩沖液A(10 mmol/L PBS，pH 8.0，1 mmol/L EDTA，0.2 mol/L NaCl)和緩沖液B(10 mmol/L PBS，pH 7.4，1 mmol/L EDTA)淋洗，然后用含有0.2 mol/L鹽酸普魯卡因酰胺的緩沖液B洗脫并收集洗脫組分，得到BChE，經(jīng)充分透析后冷凍干燥保存。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAGE)檢驗純化結(jié)果。

1.3.3BChE的有機磷抑制反應 將BChE(或血清)溶于0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)中，加入沙林至濃度為1.8 mmol/L，37 ℃溫育2 h。過量的沙林透析去除，并對終產(chǎn)物進行酶活測定，驗證BChE被完全抑制。

1.3.4BChE(或沙林-BChE)的膠內(nèi)酶切 配制10%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳，沙林處理過的BChE樣品與BChE空白樣品分二孔點樣，120 V電泳2 h。目標條帶處切取膠塊后，經(jīng)脫色、脫水，加入胰蛋白酶，37 ℃酶解過夜。

1.3.5質(zhì)譜檢測分析 取1 μL酶解原液，與等體積基質(zhì)CCA飽和溶液混勻，點樣于靶板上，空氣中自然干燥后形成共結(jié)晶，進行質(zhì)譜分析。所用儀器為Ultraflex MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀，采用反射正離子模式。首先用TOF MS模式檢測酶解肽段[M+H]+峰，然后用LIFT模式對目標肽段進行串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)分析。采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)Flexanalysis 2.4和Biotools 3.0處理，并鏈接MASCOT在線數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)比對及解析。

1.3.6染毒血清樣品中有機磷毒劑追溯性檢測 取普魯卡因酰胺-Sepharose 4B親和凝膠裝填空SPE柱(凝膠體積約1 mL)，4 ℃存放備用。染毒血清首先用30%硫酸銨分級沉淀，上清液轉(zhuǎn)入YM-10超濾管中超濾去除鹽成分，含BChE組分溶于水中。所得樣品經(jīng)自制的普魯卡因酰胺-Sepharose 4B SPE柱富集后，先用緩沖液A(10 mmol/L PBS，pH 8.0，1 mmol/L EDTA，0.2 mol/L NaCl)和緩沖液B(10 mmol/L PBS，pH 7.4，1 mmol/L EDTA)淋洗，然后用含有0.2 mol/L鹽酸普魯卡因酰胺的緩沖液B洗脫BChE加合物，收集洗脫組分，轉(zhuǎn)入YM-10超濾管中，超濾去除鹽成分，含BChE組分溶于20 μL水中存放。取4 μL樣品，加熱變性3 min(100 ℃)，冷卻后加入胰蛋白酶，37 ℃酶解2 h。取1 μL酶解液進行質(zhì)譜分析，SPE柱再生后用去離子水平衡后可重復使用。

2 結(jié)果與討論

沙林進入血液作用于BChE，與活性位點Ser198發(fā)生親核反應，形成BChE加合物，從而導致酶失活，引發(fā)中毒反應。沙林與BChE結(jié)合后，會逐漸發(fā)生水解反應，引起進一步的衰變，即所謂的“老化”現(xiàn)象，得到較穩(wěn)定的老化產(chǎn)物[10-11]，示于圖1。因此可以通過檢測BChE的Ser198位點是否被修飾，來判斷生物體是否曾暴露于毒劑環(huán)境中[12]。

圖1 BChE的沙林染毒反應Fig.1 Covalent binding of sarin to human BChE

2.1BChE的分離純化

由于血清樣品成分復雜，BChE豐度低，因此許多高豐度蛋白質(zhì)在酶解、質(zhì)譜分析過程中都會產(chǎn)生干擾[13-14]。首先利用普魯卡因酰胺-Sepharose 4B親和層析色譜對血清中的BChE進行純化。血清經(jīng)過硫酸銨沉淀、親和層析色譜處理后，其中的BChE已達到一定的純度，可用于肽指紋譜的建立，示于圖2。實驗表明，該方法對沙林-BChE加合物的富集與純化有效，也為建立快速的預處理方法提供依據(jù)和參考。

a.硫酸銨沉淀所得樣品；b.親和層析所得樣品圖2 BChE純化樣品SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electropherogram of purified BChE

2.2BChE染毒前后肽指紋譜比較

純化后的BChE用胰酶酶解后進行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，獲得了未染毒BChE樣品肽指紋譜，示于圖3a，此譜圖在MASCOT數(shù)據(jù)庫中的搜索比對結(jié)果與人血清BChE高度一致(匹配值154，誤差率8.1×1012)，BChE序列的覆蓋率為25%(人血清BChE登記號P06276)。其中[M+H]+2 928.538 u所對應的是含有活性位點Ser198肽片段(191SVTLFGES198AGAASVSLHLLSPGSHSL-FTR219)。用同樣的方法也獲得了沙林染毒后BChE肽指紋譜，示于圖3b。

BChE被沙林染毒后，[M+H]+2 928.538 u離子峰消失，出現(xiàn)[M+H]+3 048.411 u離子峰，示于圖3。這與沙林-BChE加合物的修飾位點在Ser198的推測相符(修飾肽段[M+H]+理論值為3 048.6 u)[11]。同時也檢測到加合物的老化產(chǎn)物，分子離子峰為 3 006.456 u。

為進一步確認沙林的被修飾位點，將染毒前后含Ser198的目標肽段作為母離子進行串聯(lián)質(zhì)譜分析。未染毒肽片段([M+H]+2 928.538 u)和染毒后肽片段([M+H]+3 048.411 u)，分別示于圖4a和4b。譜圖中豐度較高的碎片離子大部分為y系列離子，豐度最高的[M+H]+對應的是Ser210與Pro211間斷裂產(chǎn)生的y9碎片離子(PGSHSLFTR)，這與脯氨酸N端極易碰撞誘導解離的報道相符[15]。

圖3 BChE染毒前(a)和染毒后(b)MALDI-TOF肽指紋譜圖Fig.3 MALDI-TOF peptide mass fingerprint of before exposure (a) and after exposure (b) for BChE

根據(jù)y系列離子對譜圖進行手工解析，從圖4a可得到包括活性位點Ser198在內(nèi)的21個連續(xù)的氨基酸殘基序列194LFGESAGAASVSLHLLSPGSH214，從圖4b可得到的連續(xù)序列為198S*AGAASVSLHLLS××SH214。比較碎片離子峰，y22(SAGAASVSLHLLSPGSHSLFTR)在染毒前后發(fā)生了變化，圖4a中y22 [M+H]+為2 194.948 u，圖4b中y22 [M+H]+為2 314.839 u，相對分子質(zhì)量增加了120 u，恰好是沙林磷?；鶊F的修飾，因此直接證明了沙林對BChE Ser198的修飾。而其他位置的Ser(如Ser203、Ser205、Ser210、Ser213)對應的y17、y15、y10、y7離子與空白樣品相比，相對分子質(zhì)量均未發(fā)生變化，該結(jié)果證明了沙林可專一作用于BChE的Ser198位點。

圖4b中豐度最高的是[M+H]+2 910.476 u，與母離子質(zhì)荷比相差約138 u，這可能是由于肽段在二級碎裂過程中，在高能量作用下，磷?；鶊F從活性位點Ser198解離下來，Ser198進一步脫水形成碎片離子。但是與空白樣品相比，未發(fā)現(xiàn)被修飾后y23、y24、y25、y26碎片離子，這可能是碎片離子存在磷?；鶊F導致質(zhì)譜信號變?nèi)跛?。從沙林染毒后的BChE肽指紋譜中也能觀察到此現(xiàn)象，即磷?；碾亩坞x子峰強度大大減弱。因此增加磷?；亩蔚馁|(zhì)譜響應信號，將是提高方法靈敏度的重要手段。

為了在實際樣品分析時可以對譜圖做出快速判斷，經(jīng)過比較分析，給出了BChE的常見特征肽段，列于表1。

圖4 染毒前(a)和染毒后(b)BChE191～209的MS/MS譜圖Fig.4 MS/MS spectra of before exposure (a) and after exposure (b) for tryptic peptide BChE191—209

表1 BChE特征性指紋片段

注：粗體表示含有活性位點Ser198的目標肽段，上列為未染毒肽段，下列為沙林染毒后肽段；S表示活性位點Ser198，S*表示被沙林修飾的Ser198

2.3血液樣品中沙林-BChE加合物檢測及在有機磷毒劑染毒中的應用

由于血清樣品中BChE豐度低，因此樣品的親和預處理方法是整個分析過程中重要的一步。在實際樣品分析時，一般染毒樣品量較少，常規(guī)的親和色譜會由于非特異性吸附等原因損失目標物，導致錯誤的分析結(jié)果。本研究利用親和層析原理，采用SPE作為預處理技術，嘗試對1 mL染毒血清樣品中的BChE進行檢測。

對血清樣品進行分級沉淀處理后，首先用自制的普魯卡因酰胺-Sephrose 4B SPE柱對血清進行預處理，洗脫液經(jīng)超濾除鹽后，按1.3對樣品進行酶解、質(zhì)譜分析，其肽指紋譜圖示于圖5?？梢钥吹?，雖然使用快速分離技術導致使用肽指紋譜分析的樣品純度不高，但仍可以很清晰地歸屬表1中的9個BChE胰酶解特征片段，表明樣品中存在BChE，根據(jù)[M+H]+為3 048.526 u可進一步斷定沙林-BChE加合物的存在。

圖5 微量染毒血樣中BChE的MALDI-TOF肽指紋譜圖Fig.5 MALDI-TOF spectra of tryptic peptides of BChE in microscale serum exposure to sarin

由于肽指紋譜是根據(jù)酶解片段相對分子質(zhì)量的變化來判定BChE是否被染毒，因此該方法還應用于其他有機磷毒劑染毒的判斷[16-17]。利用所建立的快速樣品預處理技術，對其他有機磷毒素染毒血清樣品進行了追溯性檢測，均達到了預期的檢測目的，列于表2。

表2 血清樣品中有機磷毒劑染毒檢測MS結(jié)果

注：粗體表示各種有機磷毒劑染毒后目標肽段相對分子質(zhì)量

3 結(jié)論

本研究利用胰蛋白酶酶解方法[18]，結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜，進一步發(fā)展了樣品預處理方法，建立了血液樣品中染毒BChE的鑒定方法。該方法樣品用量少，操作簡便、省時，靈敏度高，可用于OPCW生物醫(yī)學樣品的毒劑暴露染毒追溯性檢測。同時，由于不同毒劑與BChE活性位點結(jié)合的磷?；鶊F不同，還可以通過目標肽段相對分子質(zhì)量的變化來鑒定毒劑的種類。利用該原理及方法還可以進行有機磷農(nóng)藥及氨基甲酸酯類殺蟲劑中毒的血清檢測[19-20]，適用于農(nóng)藥中毒檢測等領域。

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DetectionofSarin-ButyrylcholinesteraseAdductinHumanSerumbyMALDI-TOFMassSpectrometry

YAO Ge, CAO Ying, FAN Chong-xu, LIU Shang-yi, DAI Xian-dong, WEN Xiao-bo, CHEN Ji-sheng

(ResearchInstituteofPharmaceuticalChemistry,Beijing102205,China)

The analysis of biomedical samples is one part of the verification programs of OPCW (Organization for the Prohibition of Chemical Weapons), and the results would be used as evidence in case of allegations of chemical agents use. The organophosphorus nerve agents could covalently conjugate with human butyrylcholinesterase (BChE), which is one of the most important biomarkers to verify an exposure to nerve agents. In this paper, the affinity SPE technology was employed as pretreatment method on the case of the detection of serum samples. The difference of peptide mass fingerprints between BChE and sarin-BChE was compared by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) combined with trypsin digest, and the modified tryptic peptide by sarin ([M+H]+3 048.411 u) was found. The unmodified and modified fragments were also verified by tandem mass spectrometry, and the modified site could be attributed to Ser198. The method of verification of human plasma exposure to sarin can be used to track other organophosphorus agents successfully.

biomedical samples; organophosphorus nerve agents; butyrylcholinesterase; matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)

O 657.63

A

1004-2997(2013)03-0129-08

10.7538/zpxb.2013.34.03.0129

2013-03-04；

2013-04-09

姚 戈(1983～)，男，山東陽信人，博士研究生，軍事化學與煙火技術專業(yè)。E-mail: bzyaoge@yahoo.com.cn

曹 瑛(1970～)，女，山東濟寧人，副研究員，從事天然產(chǎn)物化學研究。E-mail: cao_ying2002@hotmail.com