自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織microRNA-133a與TGF-β1蛋白表達(dá)的改變及意義*

譚文鵬， 楊 侃， 陳晞明， 陳次濱

(1廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510150； 2中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院心內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410013)

自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織microRNA-133a與TGF-β1蛋白表達(dá)的改變及意義*

譚文鵬1△， 楊 侃2， 陳晞明1， 陳次濱1

(1廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510150；2中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院心內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410013)

目的觀察microRNA-133a(miR-133a)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)蛋白在自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)心肌組織中的表達(dá)改變和關(guān)系。方法取12只18周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠為SHR組，12只18周齡雄性Wistar-Kyoto (WKY)大鼠為對(duì)照組，通過無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)測(cè)大鼠尾動(dòng)脈血壓，Masson染色檢測(cè)心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)和血管周圍膠原面積比率(perivascular collagen area ratio， PVCA)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-133a表達(dá)水平，免疫組化和Western blotting法檢測(cè)心肌TGF-β1蛋白表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，SHR組的收縮壓和舒張壓明顯升高(P<0.01)，心肌CVF和PVCA明顯升高(P<0.01)，TGF-β1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，miR-133a表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，SHR組心肌miR-133a表達(dá)水平為對(duì)照組的(23.9±4.6)%；SHR組心肌組織miR-133a與TGF-β1蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.791，P<0.01)。結(jié)論SHR心肌組織miR-133a表達(dá)下調(diào)，伴隨TGF-β1蛋白表達(dá)升高和膠原合成增加。miR-133a與TGF-β1可能參與SHR大鼠的心肌纖維化。

微小RNA； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1； 自發(fā)性高血壓大鼠； 心肌纖維化

高血壓是常見的心血管疾病，能導(dǎo)致心肌纖維化、心肌肥厚等心臟病理生理改變，從而引起心力衰竭、心律失常等不良預(yù)后。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是內(nèi)源性非編碼的小分子RNA，通過調(diào)控基因表達(dá)廣泛參與生命進(jìn)程及疾病發(fā)生發(fā)展[1-2]。目前研究表明，miRNAs在心肌纖維化、心肌肥厚等心血管疾病的病理生理過程中具有重要的調(diào)控作用[3-6]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是公認(rèn)的促纖維化細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)膠原、蛋白聚糖等細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix,ECM)成分合成，從而促進(jìn)心肌纖維化[7-8]。研究表明，在尼古丁誘導(dǎo)的犬心房成纖維細(xì)胞，microRNA-133a(miR-133a)表達(dá)受抑制，導(dǎo)致TGF-β1蛋白表達(dá)上調(diào)伴隨大量膠原合成，miR-133a能通過調(diào)節(jié)TGF-β1蛋白表達(dá)參與成纖維細(xì)胞膠原合成[9]。但是目前在高血壓病中，miR-133a與TGF-β1蛋白表達(dá)關(guān)系的研究報(bào)道較少。本文通過檢測(cè)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)心肌組織中的miR-133a與TGF-β1蛋白表達(dá)水平，對(duì)二者在高血壓引起的心肌纖維化中關(guān)系進(jìn)行探討。

材 料 和 方 法

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象 14周齡的雄性SHR和Wiskar-Kyoto(WKY)大鼠各12只，體質(zhì)量220～240 g，購(gòu)自北京維通利華生物公司，許可證編號(hào)為SCXK(京)2006-0009。

1.2材料與設(shè)備 TGF-β1小鼠單克隆抗體(MAB240，R&D)；辣根過氧化物酶結(jié)合的馬抗鼠Ⅱ抗、ABC試劑盒和DAB試劑盒(Vector)；Trizol試劑(Invitrogen)；miScript Reverse Transcription Kit、miR-133a引物和U6內(nèi)參照(Qiagen)；蛋白裂解液(西安晶彩公司)；Western blotting羊抗鼠Ⅱ抗、β-actin內(nèi)參照(Jackson)。動(dòng)物恒溫系統(tǒng)和無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)(上海奧爾科博公司)；石蠟切片機(jī)(Leica)；光學(xué)顯微鏡(Nikon)；PCR儀(Bio-Rad)；電泳儀、電泳槽(北京六一儀器廠)。

2方法

2.1大鼠血壓測(cè)量 用無(wú)創(chuàng)測(cè)壓法測(cè)大鼠尾動(dòng)脈壓，在大鼠安靜清醒狀態(tài)下測(cè)量血壓。恒溫系統(tǒng)加熱至39 ℃，使尾動(dòng)脈出現(xiàn)明顯的搏動(dòng)波，尾袖氣囊充氣阻斷尾動(dòng)脈搏動(dòng)波，緩慢放氣測(cè)量血壓，反復(fù)測(cè)3次。觀察4周，SHR血壓持續(xù)明顯升高，WKY大鼠血壓正常作為正常對(duì)照，2組均在18周齡時(shí)取心臟標(biāo)本。

2.2大鼠心臟標(biāo)本處理 稱量大鼠體質(zhì)量，10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，取出心臟，在冰生理鹽水中清洗血液，無(wú)菌濾紙吸干水分，減去心房組織和右心室游離壁，電子天平稱取左心室重量。左室重量指數(shù)(left ventricular weight index，LVWI)=左心室重量(mg)/體質(zhì)量(g)。垂直于心室長(zhǎng)軸，在中點(diǎn)處將左心室橫切成兩半，心尖部用4%多聚甲醛固定8 h，乙醇梯度脫水后石蠟包埋，做形態(tài)學(xué)檢測(cè)；心底部放入凍存管，-80 ℃超低溫冰箱儲(chǔ)存，行分子生物學(xué)檢測(cè)。

2.3大鼠心肌組織Masson染色及觀察 作心肌組織石蠟切片(厚5 μm)，常規(guī)脫蠟后行Masson膠原染色。光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織膠原改變。通過NIS-Elements 圖像軟件攝取照片，并測(cè)定膠原面積在視野中所占面積百分比。每張切片選 5個(gè)不含血管和瘢痕組織視野，測(cè)量心肌膠原容積分?jǐn)?shù)[collagen volume fraction，CVF(%) =心肌膠原面積/所測(cè)視野面積×100%]；每張切片任選 3支小動(dòng)脈，測(cè)量血管周圍膠原面積比率(perivascular collagen area ratio，PVCA=小動(dòng)脈周圍膠原面積/小動(dòng)脈管腔面積)。

2.4免疫組化法檢測(cè)心肌組織TGF-β1蛋白表達(dá) 切片脫蠟后80 ℃抗原熱修復(fù)20 min，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶；封閉2 h，加TGF-β1小鼠單克隆抗體(1∶50)，4 ℃孵育過夜；辣根過氧化物酶結(jié)合的馬抗鼠Ⅱ抗(1∶400)，室溫孵育2 h；ABC工作液孵育2 h，DAB法顯色，脫水后封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，組織中棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色，每個(gè)組織切片取5個(gè)視野拍照，通過NIS-Elements BR 3.00 圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析，陽(yáng)性面積占組織切片面積的比例為陽(yáng)性數(shù)值。

2.5Western blotting法檢測(cè)心肌組織TGF-β1蛋白水平 提取心肌組織總蛋白，Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量；10 % SDS-PAGE 膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜；封閉1 h，TGF-β1小鼠單克隆抗體(1∶10 000)4 ℃孵育過夜；羊抗鼠Ⅱ抗(1∶2 000)室溫孵育1 h；顯色顯影定影，掃描膠片，用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time qPCR)檢測(cè)心肌組織miR-133a表達(dá) 取100 mg大鼠心臟組織，Trizol試劑盒提取心肌總RNA；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：miScript HiFlex Buffer 2 μL，Nucleics Mix 1 μL，miScript Reverse Transcriptase Mix 1 μL，總RNA 6 μL，混勻后短暫離心，37 ℃反應(yīng)1 h， 95 ℃水浴5 min，將得到的cDNA 置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，miScript Universal Primer 1 μL，miR-133a引物or U6 1 μL，SYBR Green qPCR Mix10 μL，水7 μL，反應(yīng)條件95 ℃ 15 s， 58 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)后PCR 儀采集熒光信號(hào)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中調(diào)整基線和閾值，達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)為各反應(yīng)孔的Ct值。目的基因相對(duì)量=2-ΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參照基因。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，變量間的相關(guān)分析采用Pearson直線相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1大鼠一般資料

與對(duì)照組比較，SHR組尾動(dòng)脈收縮壓和舒張壓明顯升高(P<0.01)，LVWI明顯增大(P<0.05)，見表1。

2大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果

對(duì)照組可見紅色心肌細(xì)胞排列整齊緊密，細(xì)胞間隙散在少量藍(lán)色膠原纖維，SHR組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙增寬，可見大量藍(lán)色膠原纖維沉積，見圖1。對(duì)心肌膠原纖維定量分析顯示，SHR組的CVF和PVCA較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，見表1。

Figure 1. Masson staining of myocardial tissues of rats(×400). A：control group；B ：SHR group.

圖1大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果

表1兩組大鼠一般資料與心肌膠原含量的變化

Table 1. Characteristics and changes of collagen in myocardial tissues of rats(mean±SD.n=12)

GroupSBP(mmHg)DBP(mmHg)LVWI(mg/g)CVF(%)PVCAControl118.6±7.876.2±6.72.38±0.322.87±0.340.81±0.11SHR192.7±15.4**102.0±9.3**3.05±0.46*5.56±0.61**1.34±0.28**

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

3大鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達(dá)改變

免疫組化檢測(cè)顯示，TGF-β1主要在成纖維細(xì)胞表達(dá)，分布在細(xì)胞膜、胞漿及細(xì)胞間隙，對(duì)照組心肌有少量TGF-β1表達(dá)，SHR組心肌可見TGF-β1大量表達(dá)，見圖2。Western bltting檢測(cè)顯示，SHR組心肌TGF-β1蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(1.21±0.14vs0.65±0.07，P<0.01)，見圖3。

Figure 2. Immunohistochemical staining of TGF-β1in myocardial tissues of rats(×400). A：control group；B ：SHR group.

圖2大鼠心肌TGF-β1免疫組化染色

Figure 3. Changes of protein expression of TGF-β1in myocardial tissues of rats.

圖3大鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達(dá)改變

4大鼠心肌組織miR-133a表達(dá)

miR-133a的熔解曲線均為單峰狀，表明PCR產(chǎn)物無(wú)污染、引物二聚體和假陽(yáng)性，引物特異性良好，見圖4。Real-time qPCR結(jié)果顯示，SHR組心肌miR-133a表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，SHR組心肌miR-133a表達(dá)水平為對(duì)照組的(23.6±4.5)%。

Figure 4. Result of fluorescent quantitation of miR-133a in myocardial tissues of rats.

圖4大鼠心肌組織miR-133a熒光定量PCR結(jié)果

5大鼠心肌組織miR-133a與TGF-β1蛋白表達(dá)水平相關(guān)性分析

Pearson直線相關(guān)分析顯示，SHR組心肌組織miR-133a表達(dá)水平與TGF-β1蛋白表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.791，P<0.01)。

討 論

高血壓、心肌梗死等多種心血管疾病均可導(dǎo)致心肌細(xì)胞外間質(zhì)增生、膠原沉積，從而引起心臟結(jié)構(gòu)功能異常[10]。TGF-β是公認(rèn)的具有重要作用的促纖維化細(xì)胞因子，TGF-β1能通過自分泌和旁分泌，作用于成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)其表型改變，使膠原合成能力顯著提高[7-8]。

miRNA是內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的小分子RNA，主要功能是通過調(diào)控基因表達(dá)廣泛參與生命進(jìn)程及疾病發(fā)生發(fā)展[11]。miR-133a是肌肉特異性miRNA，在心肌含量豐富，研究顯示， double-miR-133a基因敲除小鼠的心臟發(fā)生嚴(yán)重的心肌纖維化，并最終因心力衰竭死亡，表明miR-133a在心肌細(xì)胞間質(zhì)合成平衡中具有關(guān)鍵作用[12]。在心肌梗死病人及主動(dòng)脈縮窄動(dòng)物模型中，心肌miR-133表達(dá)水平均出現(xiàn)明顯降低[13-14]。研究表明，體外培養(yǎng)的心房成纖維細(xì)胞在尼古丁刺激下，miR-133a表達(dá)水平下調(diào)了60%～70%，并導(dǎo)致TGF-β1蛋白水平顯著升高，伴隨大量膠原合成；miRNA TargetScan 系統(tǒng)分析顯示miR-133a與TGF-β1mRNA的3’-URT有多個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)；心房成纖維細(xì)胞miR-133的過表達(dá)，可以明顯減少TGF-β1蛋白表達(dá)和膠原合成，這一作用可以被miR-133的反義寡核苷酸(AMO-133)抵消[9]。但是在高血壓病中miR-133a與TGF-β1的表達(dá)關(guān)系目前尚未見研究報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，18周齡SHR出現(xiàn)了明顯的心肌纖維化，Masson染色可見SHR心肌細(xì)胞間隙和血管周圍有大量膠原纖維沉積，CVF及PVCA均較對(duì)照組明顯升高。免疫組化檢測(cè)顯示SHR心肌合成大量TGF-β1，在細(xì)胞膜、胞漿內(nèi)及細(xì)胞間隙均有表達(dá)，表明TGF-β1作為分泌蛋白發(fā)揮促纖維化作用。進(jìn)一步采用Western boltting法進(jìn)行蛋白定量發(fā)現(xiàn)，SHR心肌TGF-β1蛋白水平較對(duì)照組升高了1倍左右。Real-time qPCR檢測(cè)顯示，SHR心肌miR-133a表達(dá)水平顯著降低，為對(duì)照組水平的四分之一左右，miR-133a水平與TGF-β1蛋白水平呈顯著負(fù)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)表明，miR-133a在SHR心肌中表達(dá)降低，可能對(duì)TGF-β1的抑制作用減弱，導(dǎo)致TGF-β1蛋白合成增加，引起心肌纖維化。是否能通過調(diào)節(jié)miR-133a的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)TGF-β1蛋白表達(dá)的抑制作用，從而改善高血壓病的心肌纖維化有待進(jìn)一步研究。

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RelationshipofmicroRNA-133aandTGF-β1proteininmyocardialtissuesofspontaneouslyhypertensiverats

TAN Wen-peng1, YANG Kan2, CHEN Xi-ming1, CHEN Ci-bin1

(1DepartmentofCardiology,theThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510150,China;2DepartmentofCardiology,theThirdXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410013,China.E-mail: 492452050@qq.com)

AIM: To observe the changes of microRNA-133a and transforming growth factor β1(TGF-β1) protein in the myocardium of spontaneously hypertensive rats (SHR).METHODSMale SHR (18 weeks old,n=12) and male Wistar-Kyoto rats (WKY, 18 weeks old,n=12) served as SHR group and control group, respectively. Caudal arterial blood pressure was detected by a noninvasive blood pressure measurement and analysis system. Myocardial collagen volume fraction (CVF) and perivascular collagen area ratio (PVCA) were determined by Masson staining. The level of miR-133a in the heart was detected by real-time quantitative PCR. The protein level of TGF-β1in the heart was also analyzed by the methods of immunohistochemisty and Western blotting.RESULTSCompared with control group, systolic and diastolic blood pressure, CVF and PVCA significantly increased, the expression of TGF-β1protein was significantly up-regulated, and the level of miR-133a was significantly reduced in SHR group. In SHR group, the expression of miR-133a was decreased to (23.9±4.6)% in control group. A negative correlation between the levels of miR-133a and TGF-β1protein in SHR group was observed (r=-0.791,P<0.01).CONCLUSIONThe level of miR-133a is down-regulated along with the up-regulation of TGF-β1protein expression and collagen synthesis in the myocardial tissues of SHR. miR-133a and TGF-β1may be involved in myocardial fibrosis in SHR.

MicroRNA; Transforming growth factor β1; Spontaneously hypertensive rats; Myocardial fibrosis

R544.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.031

1000- 4718(2013)04- 0748- 04

2012- 10- 08

2013- 03- 01

廣州醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(No.2012C59)

△通訊作者 Tel: 020-81292119; E-mail: 492452050@qq.com