骨髓間充質(zhì)干細胞在小鼠早衰性骨質(zhì)疏松中的細胞生物學功能研究*

杲 麗， 胡成虎， 金 巖

(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院口腔組織病理學教研室，組織工程研發(fā)中心，陜西 西安 710032)

骨髓間充質(zhì)干細胞在小鼠早衰性骨質(zhì)疏松中的細胞生物學功能研究*

杲 麗， 胡成虎， 金 巖△

(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院口腔組織病理學教研室，組織工程研發(fā)中心，陜西 西安 710032)

目的研究在小鼠早衰性骨質(zhì)疏松癥中骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSCs)功能的變化，為揭示骨質(zhì)疏松發(fā)病機制提供理論依據(jù)。方法以早衰小鼠(SAMP6)為動物模型(對照小鼠：SAMR1)，分離培養(yǎng)3個月與6個月小鼠的BMMSCs，利用流式細胞術進行干細胞表型鑒定后用于基因芯片檢測篩選差異表達基因，并對該結(jié)果進行了Pathway分析。分離培養(yǎng)鑒定2組的BMMSCs并對其成骨與成脂的分化能力進行比較，在誘導分化后進行實時定量RT-PCR檢測相關基因的表達，揭示骨髓間充干細胞功能在早衰性骨質(zhì)疏松中的改變。結(jié)果本研究證明了隨著年齡的增長，骨髓間充質(zhì)干細胞成骨能力降低而成脂能力增高；芯片結(jié)果的Pathway分析顯示，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)信號通路有4個關鍵基因發(fā)生改變，提示TGF-β信號通路可能在此過程中發(fā)揮重要作用。結(jié)論隨著年齡增長，早衰性骨質(zhì)疏松個體的骨髓間充質(zhì)干細胞生物學功能及TGF-β通路發(fā)生了改變，為通過改變骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學功能從而有效逆轉(zhuǎn)治療、改善骨質(zhì)疏松狀態(tài)提供靶點和理論依據(jù)。

骨髓間充質(zhì)干細胞； 骨質(zhì)疏松； 衰老； 細胞分化

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是一種多因素所致的慢性疾病，其病理學表現(xiàn)為骨組織顯微結(jié)構(gòu)受損，骨質(zhì)變薄、骨小梁數(shù)量減少、骨脆性增加和骨折危險度升高。骨具有發(fā)育、增齡、衰老的過程，骨的生物學特點在于保持著穩(wěn)定的生理性平衡，即成骨和破骨的平衡，任何打破這種平衡的因素都可能導致病理性疾病的發(fā)生[1]。關于骨質(zhì)疏松機制的研究過去主要集中在破骨細胞異?；罨?，但是，近些年來，越來越多的學者認為，成骨-破骨平衡破壞才是骨質(zhì)疏松的根本原因[2]。

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)作為成骨細胞的前體細胞，在骨骼發(fā)育和重建過程中發(fā)揮著重要作用。隨著年齡的增長，BMMSCs的生物學行為也會發(fā)生變化，當衰老影響到骨髓間充質(zhì)干細胞的自我更新和定向分化能力時，骨組織也會和其它組織一樣出現(xiàn)退行型病變，其中最典型的便是骨質(zhì)疏松[3]。通過基因敲除小鼠研究增齡性骨質(zhì)疏松與骨髓間充質(zhì)干細胞功能不良的相關性，其中的一些關鍵基因在BMMSCs成骨分化過程中起重要作用，其缺失可能導致骨質(zhì)疏松的發(fā)生[4-5]。例如，在Bgn-/-小鼠中BMMSCs克隆形成能力下降，凋亡活動增強，合成I型膠原能力降低[4]；Casp3-/-和Casp3+/-小鼠中的 BMMSCs 骨向分化功能也受到嚴重損傷[5]。這表明干細胞損傷對于衰老具有不可忽視的作用，同時可能在骨質(zhì)疏松的發(fā)生中起關鍵性作用[6]。這些結(jié)果提示骨質(zhì)疏松與干細胞功能不良具有明顯的相關性。另外，對于骨發(fā)育缺陷疾病，已有研究嘗試移植骨髓來源的間充質(zhì)干細胞來重建骨髓的成骨微環(huán)境，以治療嚴重的成骨不全[7]。并有臨床實驗表明，通過間充質(zhì)干細胞的移植可以在一定時間內(nèi)使成骨不全患者的骨骼生長速度加快，骨質(zhì)含量提高、骨折發(fā)生率下降，說明干細胞將可能成為治療骨發(fā)育、衰老相關疾病的新策略[8]。然而，在年齡的影響下，BMMSCs的生物學功能是否存在缺陷，其發(fā)展變化的分子調(diào)控機制尚不清楚，關鍵基因和信號通路對骨相關干細胞的自我更新及分化的調(diào)控機制尚未完全清楚。這不僅極大地限制了有效預防骨質(zhì)疏松為代表的骨增齡疾病的發(fā)生，同時限制了干細胞技術治療增齡所帶來的骨質(zhì)疏松及缺損等疾病的應用。在本研究中，我們使用早衰小鼠模型，通過分離不同年齡段的BMMSCs并比較分析生物學行為，利用基因芯片尋找可能發(fā)揮作用的關鍵信號通路，試圖從基因調(diào)控水平探尋BMMSCs在增齡性骨質(zhì)疏松中的重要作用及可能的分子機制。

材 料 和 方 法

1動物模型

SPF級SAMR1與SAMP6小鼠購買于北京大學醫(yī)學部實驗動物中心，實驗室常規(guī)飼養(yǎng)3個月及6個月用于實驗。隨機抽取相應的雄性小鼠分為對照組SAMR1小鼠和實驗組SAMP6小鼠，每組3只小鼠。

2主要試劑

SCA-1-FITC、CD29-PE、CD45-PE和CD11b-FITC抗小鼠單克隆抗體購自Abcam；DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；地塞米松、維生素C、胰島素、吲哚美辛和異丁基甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)購自Sigma；Trizol?Reagent購自Invitrogen；RT-PCR試劑盒購自TaKaRa；其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

3主要方法

3.1骨組織切片染色 小鼠頸椎脫臼致死后，75%乙醇浸泡2～3 min消毒，剝?nèi)‰p側(cè)脛骨及股骨，剔除表面肌肉及軟組織，多聚甲醛固定24 h后于10%EDTA脫鈣28 d，隔天換液，流水沖洗過后石蠟包埋，常規(guī)切片，進行蘇木精-伊紅(HE)染色。光鏡下觀察并照相。

3.2BMMSCs分離培養(yǎng) 小鼠頸椎脫臼致死后，75%乙醇浸泡2～3 min消毒，依次剪開皮膚、筋膜達肌肉層，剝?nèi)ッ劰呛凸晒?，剔除表面肌肉及軟組織，以1 mL針管沖洗骨髓腔將細胞懸液接種于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)。每2 d進行半量換液，當細胞融合密度達到80%以后，以5×105/cm2的密度傳代。取P4代以前的細胞用于實驗。

3.3干細胞表面標志物鑒定 取P1代的SAMP6小鼠細胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，胰蛋白酶消化3 min，DMEM培養(yǎng)液終止，800 r/min離心5 min，棄上清，再用含3%胎牛血清的PBS重懸細胞，使細胞密度達3.0×109/L，分裝到離心管中，每管200 μL的細胞懸液，室溫下每個管分別加入2 μL SCA-1-FITC、CD29-PE、CD45-PE和CD11b-FITC抗小鼠單克隆抗體，使用同型對照單克隆抗體確定背景，避光4 ℃冰箱孵育2 h，再用含3%胎牛血清的PBS洗3次，1 000 r/min離心5 min，最后再以3%胎牛血清重懸，用流式細胞儀分析熒光細胞，專用的配套設計軟件計算細胞表面抗原陽性表達率，單位用百分比表示。

3.4BMMSCs的成骨和成脂誘導 成骨誘導液為DMEM加入10%胎牛血清、100 nmol/L地塞米松、2 mmol/L甘油磷酸鈉和50 mg/L維生素C；成脂誘導液為DMEM加入10%胎牛血清、200 μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX 10 mg/L胰島素和1 μmol/L地塞米松。細胞按照3×105cells/well接種于6孔板內(nèi)，48 h更換成骨成脂誘導液進行培養(yǎng)。每3 d換液1次，分別在誘導3 d、7 d和14 d用Trizol?Reagent提取RNA,同時分別對成骨和成脂誘導7 d后的BMMSCs進行，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和油紅O染色，在誘導14 d后進行茜素紅染色；對相關基因[Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2, Runx2)、Osterix、過氧化物酶體增殖物激活受體γ2(peroxisome proliferator-activated receptor γ2, PPARγ2)和脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4, FABP4)]進行PCR檢測，檢測2組細胞中基因表達的差異情況。

3.5基因芯片檢測 取間充質(zhì)干細胞流式鑒定的同批次3個月及6個月SAMP6小鼠各6只， 取股骨及脛骨骨髓常規(guī)培養(yǎng)BMMSCs，待原代細胞密度達到80%后分別提取RNA，質(zhì)檢合格后以同組每 3個RNA樣本等量混合，將得到的每組各3個混合 RNA樣本行雙色芯片檢測 (華聯(lián)基因，杭州聯(lián)川生物信息技術有限公司)。3張芯片的信號數(shù)據(jù)進行歸一化處理后，進行統(tǒng)計學分析。

3.6RT-PCR檢測 按照RT-PCR試劑盒產(chǎn)品使用說明書對所提取RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應并用ABI7500RT-PCR儀進行檢測。所用引物由上海英杰生命科技有限公司根據(jù)設計合成，見表1。

4統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 18.0軟件進行分析，兩組均數(shù)比較采用雙尾成組t檢驗(two-tailed unpaired Student’st-test)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 引物序列

結(jié) 果

1骨組織切片HE染色

SAMP6早衰小鼠是一種骨特異性衰老模型，骨峰值在3月出現(xiàn)，在4個月即表現(xiàn)出明顯的骨質(zhì)疏松。我們通過對3個月和6個月小鼠股骨骨組織脫鈣后進行縱切，切片分析發(fā)現(xiàn)與年輕組和同年齡階段的對照組SAMR1小鼠相比，早衰組出現(xiàn)了明顯的骨質(zhì)疏松。6個月小鼠骨組織皮質(zhì)骨的厚度、骨表面的寬度和骨小梁的數(shù)目均小于3個月對照組，見圖1。

Figure 1. HE staining of the trabecular region below the distal femur growth plate from 3-month mice and 6-month mice (×400).

圖13個月與6個月小鼠股骨遠端縱切片的HE染色

2體外培養(yǎng)BMMSCs表面分子鑒定

小鼠BMMSCs經(jīng)分離、純化、培養(yǎng)后呈細長多邊形貼壁生長。流式細胞術檢測顯示：小鼠BMMSCs各個陽性與陰性指標均符合間充質(zhì)干細胞的特性，見圖2。

3BMMSCs成骨和成脂分化誘導后的比較

取P2代BMMSCs進行成骨與成脂誘導分化，分別在7 d進行ALP染色與油紅O染色，14 d進行茜素紅染色。染色結(jié)果表明：無論是年輕組還是早衰組，成骨誘導后，ALP活性均上升，且都伴隨明顯的骨礦化結(jié)節(jié)形成；但早衰組BMMSCs成骨誘導后，其ALP活性與骨礦化能力均明顯不如年輕組與同年齡階段的正常對照組，且年輕組與正常對照組在不誘導情況下，有輕微的骨礦化能力。

早衰組、年輕組與對照組在不經(jīng)誘導的情況下，均能自發(fā)形成少量的脂肪細胞。經(jīng)成脂分化誘導后，均出現(xiàn)大量的脂滴累積，但早衰組成脂能力明顯最強，見圖3。

Figure 2. Identification of BMMSCs by flow cytometric analysis of mesenchymal stem cell surface markers,using Sca-1 and CD29 as positive markers, and CD11b and CD45 as negative markers.

圖2小鼠BMMSCs表面分子的流式細胞術鑒定

Figure 3. Osteogenic and adipogenic differentiation of BMMSCs determined by alizarin red staining, ALP staining and oil red O staining (×100). Con: control; Ost: osteogenic induction; Adi: adipogenic induction.

圖3BMMSCs成骨誘導后的茜素紅(14d)與ALP(7d)染色，以及成脂誘導7d后的油紅O染色

4RT-PCR檢測結(jié)果

與成骨、成脂分化染色BMMSCs同批收取分化7 d后的細胞進行基因定量分析,結(jié)果表明：早衰組成骨指標Runx2與Osterix的表達明顯低于年輕組，而與之相反的是早衰組的成脂指標PPARγ2與FABP4表達顯著高于年輕組，這與前面染色結(jié)果基本一致，見圖4。

5基因芯片結(jié)果通路分析

基因芯片結(jié)果顯示早衰組與年輕組在約2萬6千個基因里，僅164個基因存在顯著差異。利用David在線數(shù)據(jù)庫(http://david.abcc.ncifcrf.gov)對該結(jié)果進行了通路分析，結(jié)果表明有12個信號通路可能調(diào)控增齡引起的間充質(zhì)干細胞功能性改變。首先對其中與骨關系比較密切的TGF-β信號通路中的4個基因(MAPK1、INHBA、DCN和GDF7)進行了差異驗證，RT-PCR結(jié)果證明芯片結(jié)果的可靠性，見表2。

討 論

SAMP6小鼠是一種骨質(zhì)疏松的早衰小鼠模型，在3～4個月左右即出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松病癥，已有研究報道這可能與骨發(fā)育重建過程中成骨能力受損有很大的關系[9]。而且隨著年齡的增大，SAMP6小鼠還表現(xiàn)出骨髓腔里脂肪的累積[10]。但這些研究卻沒有回答為什么隨著年齡增大，SAMP6會表現(xiàn)出這些的生理變化。BMMSCs屬于成體干細胞，在一定條件誘導下能夠分化成成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞等多類細胞。2006年，F(xiàn)ehrer等[11]曾從增殖的角度簡單研究過SAMP6小鼠BMMSCs的基因背景，直到2012年，Mirsaidi等[12]才從衰老和多向分化角度系統(tǒng)比較了SAMP6與對照小鼠SAMR1脂肪來源的MSCs的生物學行為。本研究以SAMP6為對象，選取不同年齡的小鼠，分離BMMSCs，從年齡的新角度探討了BMMSCs在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展過程的作用。在去勢誘發(fā)的骨質(zhì)疏松條件下，BMMSCs成骨和成脂分化平衡改變，成骨能力下降，趨向成脂分化[13-14]。有意思的是SAMP6出現(xiàn)骨質(zhì)疏松后，相比年幼個體，BMMSCs多向分化能力也有類似的轉(zhuǎn)變，這些都為骨質(zhì)疏松的生理改變提供了細胞生物學證據(jù)，BMMSCs基因水平的變化也反映了上述改變。

Figure 4. Expression of osteogenesis-related genes as well as adipogenesis specific genes investigated by real-time quantitative PCR. The expression levels were normalized to β-actin. Mean±SD.n=3*P<0.05vsSAMP6 (3 months) or SAMR1 (6 months).

圖4BMMSCs成骨、成脂分化誘導7d后，分化相關關鍵基因的檢測

表2 SAMP6小鼠3個月與6個月BMMSCs差異表達基因信號通路分析

最新研究結(jié)果表明TGF-β信號通路在骨發(fā)育重建過程中對BMMSCs的遷移發(fā)揮著十分重要的作用[15]。但在骨衰老過程中是通過影響遷移調(diào)控骨重建還是通過其它機制發(fā)揮調(diào)控作用還有待進一步研究。芯片鑒定出的4個基因在TGF-β信號通路的作用也都還不是特別清楚，因此后續(xù)還需對上述4個基因在BMMSCs成骨與成脂分化平衡的具體功能作用機制進行深入研究。

綜上所述，在早衰引起的骨質(zhì)疏松背景下，隨著年齡的增長，骨髓間充質(zhì)干細胞的多向分化能力出現(xiàn)了明顯的轉(zhuǎn)變，并且這種變化與骨質(zhì)疏松的表型相一致，提示骨髓間充質(zhì)干細胞生物學功能的改變加速了骨質(zhì)疏松的產(chǎn)生。

[1] Hadjidakis DJ, Androulakis II. Bone remodeling[J]. Ann N Y Acad Sci, 2006, 1092: 385-396.

[2] Rodan GA, Martin TJ. Therapeutic approaches to bone diseases[J]. Science, 2000, 289(5484): 1508-1514.

[3] Pietschmann P, Rauner M, Sipos W, et al. Osteoporosis: an age-related and gender-specific disease[J]. Gerontology, 2009, 55(1): 3-12.

[4] Wallace JM, Rajachar RM, Chen XD, et al. The mechanical phenotype of biglycan-deficient mice is bone- and gender-specific [J]. Bone, 2006, 39(1): 106-116.

[5] Miura M, Chen XD, Allen MR, et al. A crucial role of caspase-3 in osteogenic differentiation of bone marrow stromal stem cells [J]. J Clin Invest, 2004, 114(12): 1704-1713.

[6] Zhou Z, Apte SS, Soininen R, et al. Impaired endochondral ossification and angiogenesis in mice deficient in membrane-type matrix metalloproteinase I[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(8): 4052-4057.

[7] Horwitz EM, Gordon PL, Koo WK, et al. Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: Implications for cell therapy of bone[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(13): 8932-8937.

[8] Le Blanc K, Gotherstrom C, Ringden O, et al. Fetal mesenchymal stem-cell engraftment in bone after in utero transplantation in a patient with severe osteogenesis imperfecta[J]. Transplantation, 2005, 79(11): 1607-1614.

[9] Jilka RL, Weinstein RS, Takahashi K, et al. Linkage of decreased bone mass with impaired osteoblastogenesis in a murine model of accelerated senescence[J]. J Clin Invest, 1996, 97(7): 1732-1740.

[10] Kajkenova O, Lecka-Czernik B, Gubrij I, et al. Increased adipogenesis and myelopoiesis in the bone marrow of SAMP6, a murine model of defective osteoblastogenesis and low turnover osteopenia. Journal of bone and mineral research[J]. J Bone Miner Res,1997,12(11): 1772-1779.

[11] Fehrer C,Laschober G, Lepperdinger G. Aging of murine mesenchymal stem cells[J]. Ann N Y Acad Sci, 2006, 1067: 235-242.

[12] Mirsaidi A, Kleinhans KN, Rimann M, et al. Telomere length, telomerase activity and osteogenic differentiation are maintained in adipose-derived stromal cells from senile osteoporotic SAMP6 mice [J]. J Tissue Eng Regen Med,2012,6(5): 378-390.

[13] 楊 麗,張榮華,蔡 宇,等. 去卵巢對SD大鼠MSCs生物學特性的影響[J]. 中國病理生理雜志， 2010, 26(7): 1249-1254.

[14] 梁世楨,王國軒,范龍坤,等. 去勢大鼠骨量丟失過程中骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖分化功能[J]. 中國病理生理雜志， 2012, 28(3): 398-403.

[15] Tang Y, Wu X, Lei W, et al. TGF-beta1-induced migration of bone mesenchymal stem cells couples bone resorption with formation[J]. Nat Med, 2009, 15(7): 757-765.

Age-relatedchangesofbonemarrowmesenchymalstemcellsinsenileosteoporosis

GAO Li, HU Cheng-hu, JIN Yan

(DepartmentofOralHistology&Pathology,SchoolofStomatology,ResearchandDevelopmentCenterforTissueEngineering,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.E-mail:yanjin@fmmu.edu.cn)

AIM: To investigate the different functions of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) in age-related osteoporosis.METHODSThe senescence-accelerated mice (SAMP6) were used in the experiment. The BMMSCs were isolated from femora and tibiae by flushing. Flow cytometric analysis was performed with MSCs-related monoclonal antibodies. The expression of differentiation genes was tested by real-time RT-PCR.RESULTSIn the progress of age-related osteoporosis, BMMSCs exhibited a decrease in osteogenesis and an increase in adipogenesis. Transforming growth factor β(TGF-β) signaling was significantly changed along with aging in SAMP6 mice.CONCLUSIONThe functional changes of BMMSCs may play an important role in senile osteoporosis. The alteration of TGF-β-related gene expression may be the molecular mechanism of dysfunction in BMMSCs.

Bone marrow mesenchymal stem cells; Osteoporosis; Aging; Cell differentiation

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.023

1000- 4718(2013)04- 0707- 06

2012- 11- 30

2013- 03- 12

國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目(No.2011CB964700)

△通訊作者Tel: 029-84776472； E-mail： yanjin@fmmu.edu.cn