臍血與成人外周血粒細(xì)胞Toll樣受體表達(dá)的比較*

劉 俊, 吳 瑕, 陳智聰, 廖繼東△, 谷景義, 楊曉蕾, 柳國(guó)勝, 吳 慧, 李揚(yáng)秋

(暨南大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院田家炳醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 2第一臨床醫(yī)院, 3醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣東 廣州 510632)

臍血與成人外周血粒細(xì)胞Toll樣受體表達(dá)的比較*

劉 俊1, 吳 瑕2, 陳智聰1, 廖繼東1△, 谷景義1, 楊曉蕾1, 柳國(guó)勝2, 吳 慧2, 李揚(yáng)秋3

(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院田家炳醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，2第一臨床醫(yī)院,3醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣東 廣州 510632)

目的比較臍血與成人外周血粒細(xì)胞Toll樣受體(TLRs)的表達(dá)情況，為新生兒相關(guān)疾病的臨床治療積累實(shí)驗(yàn)資料。方法取臍血和成人外周血，用密度梯度離心結(jié)合紅細(xì)胞裂解法分離、收集粒細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)鑒定粒細(xì)胞純度，RT-qPCR檢測(cè)TLRs 10個(gè)成員的mRNA表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定部分TLRs的蛋白熒光強(qiáng)度。結(jié)果(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果：采用密度梯度離心結(jié)合紅細(xì)胞裂解法分離收集的臍血粒細(xì)胞CD19-CD24+為(95.66±1.73)%，CD3+為(4.27±1.22)%，成人外周血粒細(xì)胞CD19-CD24+為(95.48±2.13)%，CD3+為(4.82±1.07)%。(2)RT-qPCR結(jié)果顯示：臍血粒細(xì)胞和成人外周血粒細(xì)胞TLR1(0.141±0.091vs0.691±0.447)、TLR2(0.388±0.337vs0.901±0.508)、TLR4(0.093±0.071vs0.254±0.147)、TLR6(0.056±0.045vs0.202±0.034)、TLR7(0.001±0.001vs0.004±0.003)和TLR8(0.046±0.040vs0.211±0.146)的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),TLR3、TLR5、TLR9和TLR10的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；其中TLR3、TLR7和TLR9在臍血和成人外周血粒細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)水平均較低。(3)流式分析顯示臍血與成人外周血粒細(xì)胞TLR2平均蛋白熒光強(qiáng)度(21.40±3.09vs30.50±5.69)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而TLR4平均蛋白熒光強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論臍血粒細(xì)胞TLR1、TLR2、TLR4和TLR6 mRNA及TLR2蛋白表達(dá)低于成人外周血粒細(xì)胞，提示新生兒粒細(xì)胞識(shí)別細(xì)菌性病原微生物感染的能力可能存在缺陷或尚未完全成熟。這是否與新生兒急性細(xì)菌性毒血癥發(fā)病及病死率較高有直接聯(lián)系，有待進(jìn)一步研究。

新生兒； 臍血； 粒細(xì)胞； Toll樣受體； 基因表達(dá)

新生兒的感染性疾病發(fā)病率及病死率較高，天然免疫和獲得免疫系統(tǒng)均未發(fā)育成熟是其主要原因。天然免疫系統(tǒng)是新生兒時(shí)期的主要保護(hù)屏障，粒細(xì)胞是主要的天然免疫功能細(xì)胞，在保護(hù)新生兒免受細(xì)菌等病原微生物的感染中起著重要作用[1-2]。新生兒粒細(xì)胞數(shù)量不足以及功能缺陷是導(dǎo)致新生兒細(xì)菌性敗血癥死亡的主要內(nèi)因[3-4]。Toll 樣受體(Toll-like receptors， TLRs) 是天然免疫受體超家族中重要一員，可識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答和誘發(fā)調(diào)節(jié)獲得免疫[5-6]。TLRs是粒細(xì)胞重要功能受體之一[7]。Prince等[8]發(fā)現(xiàn)除TLR3和TLR7外，TLRs家族成員在中性粒細(xì)胞均有表達(dá)。本研究對(duì)臍血與成人外周血粒細(xì)胞TLRs家族所有成員的基因表達(dá)水平進(jìn)行全面的對(duì)比分析，為新生兒天然免疫狀況研究及相關(guān)疾病的臨床治療提供第一手實(shí)驗(yàn)資料。

材 料 和 方 法

1材料

取暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科分娩的胎齡介于37～42周、體重介于2.5～4.0 kg間的正常新生兒17例，其中男10例，女7例，均征得產(chǎn)婦及家屬的同意，其母在妊娠期無(wú)原發(fā)性高血壓、冠心病、糖尿病、甲狀腺疾病史、急慢性腎炎以及腫瘤等內(nèi)外科合并癥和妊娠并發(fā)癥，無(wú)酗酒吸煙、吸毒等不良嗜好；剔除因任何疾病出生3 d內(nèi)需轉(zhuǎn)新生兒病房的新生兒；成人外周血13例，取自正常自愿者，最小年齡23歲，最大年齡54歲，中位年齡30歲，男6例，女7例。

2方法

2.1血液樣本 采用2 mL EDTA-K2真空抗凝管收集，血量為4～6 mL，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱，并在1 d之內(nèi)進(jìn)行樣本的處理。

2.2粒細(xì)胞分離與收集 采用淋巴細(xì)胞分離液(購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)與紅細(xì)胞裂解液[9]分離收集粒細(xì)胞。

2.3RT-PCR

2.3.1細(xì)胞總RNA提取與鑒定 RNA提取方法按天根RNAsimple Total RNA Kit說(shuō)明書操作；取2 μL用微量核酸定量?jī)x(Thermo)檢測(cè)RNA純度以及濃度。

2.3.2引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，由Oligo 7.0設(shè)計(jì)，并用NCBI Primer-BLAST分析引物特異性滿足要求之后由上海英維捷基貿(mào)易有限公司合成，所有引物均經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，Vector NTI比對(duì)分析驗(yàn)證證實(shí)合格，引物序列見表1。

表1 TLR1～TLR10 PCR引物序列

2.3.3cDNA合成 按東洋紡ReverTra Ace qPCR RT Kit操作指南進(jìn)行。

2.3.4PCR 根據(jù)美津生物2×Taq MasterMix配置PCR反應(yīng)體系，在PCR儀(東勝創(chuàng)新)上以94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)。收集產(chǎn)物，取5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(2%)，觀察條帶大小與預(yù)期值是否一致，剩余產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Vector NTI進(jìn)行比對(duì)分析。選取擴(kuò)增片段序列與目標(biāo)序列一致的引物作為樣本分析用引物。

2.3.5RT-qPCR 根據(jù)東洋紡THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix配置PCR反應(yīng)體系，在熒光定量PCR儀(Bio-Rad PTC-200)上以95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，61 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，讀板，共45個(gè)循環(huán)。觀察擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線和熔解曲線，用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量，計(jì)算得出目的基因相對(duì)于管家基因GAPDH的量。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)志物和TLR2和TLR4表達(dá)量 取上述分離收集的細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀(FACScan，Becton Dickinson)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD3、CD19和CD24；對(duì)臍血和成人外周血粒細(xì)胞進(jìn)行TLR2和TLR4蛋白表達(dá)量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果以平均熒光強(qiáng)度表示。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，檢驗(yàn)方差齊性，采用兩組樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1粒細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

臍血粒細(xì)胞CD19-CD24+為(95.66±1.73)%，CD3+為(4.27±1.22)%，成人外周血粒細(xì)胞CD19-CD24+為(95.48±2.13)%，CD3+為(4.82±1.07)%，見圖1。CD19-CD24+細(xì)胞數(shù)均達(dá)到95%以上，且CD3+細(xì)胞率均低于6%，顯示采用密度梯度離心結(jié)合紅細(xì)胞裂解的方法分離獲得了較高純度的粒細(xì)胞。

Figure 1. The flow cytometry results of granulocytes from umbilical cord blood (A,C) and adult peripheral blood (B,D).

圖1臍血和成人外周血粒細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

2RT-PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果

RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖2，結(jié)果顯示TLR1～TLR10和GAPDH的目的條帶單一清晰且與預(yù)期值相符。

Figure 2. The agarose gel electrophoretogram of TLR1～TLR10 and GAPDH PCR products. 1：TLR1；2：TLR2；3：TLR3；4：TLR4；5：TLR5；6：TLR6；7：TLR7；8：TLR8；9：TLR9；10：TLR10；11：GAPDH; M：marker.

圖2TLR1～TLR10和GAPDHPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

3臍血與成人外周血粒細(xì)胞TLRs

RT-qPCR結(jié)果顯示，臍血粒細(xì)胞和成人外周血粒細(xì)胞TLR1(0.141±0.091vs0.691±0.447)、TLR2(0.388±0.337vs0.901±0.508)、TLR4(0.093±0.071vs0.254±0.147)、TLR6(0.056±0.045vs0.202±0.034)、TLR7(0.001±0.001vs0.004±0.003)和TLR8(0.046±0.040vs0.211±0.146)的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),TLT3、TLT5、TLR9和TLR10的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；其中TLR3、TLR7和TLR9在臍血和成人外周血粒細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)水平均較低，見圖3。

Figure 3. The comparison of TLR1～TLR10 mRNA expression in granulocytes from umbilical cord blood and adult peripheral blood.Mean±SD.**P<0.01vsadult group.

圖3臍血與成人外周血粒細(xì)胞的TLR1～TLR10mRNA表達(dá)量比較

4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR2和TLR4蛋白熒光強(qiáng)度結(jié)果

臍血與成人外周血粒細(xì)胞TLR2和TLR4的平均蛋白熒光強(qiáng)度見表2。臍血粒細(xì)胞TLR2和TLR4的平均蛋白熒光強(qiáng)度均低于成人外周血粒細(xì)胞，且兩者間TLR2的平均蛋白熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

新生兒的感染性疾病發(fā)病率及病死率較高，先天免疫和獲得免疫系統(tǒng)均未成熟是其主要原因。先天免疫系統(tǒng)是新生兒時(shí)期的主要保護(hù)屏障，粒細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)最豐富的細(xì)胞，是急性炎癥反應(yīng)的最終效應(yīng)細(xì)胞，在清除外來(lái)病原體的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。它們還參與先天和獲得免疫細(xì)胞的激活和調(diào)節(jié)過(guò)程。在包括細(xì)胞內(nèi)病原體引起的感染、自身免疫性疾病、慢性炎癥和癌癥等疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵性作用。因此，粒細(xì)胞在保護(hù)新生兒免受細(xì)菌性病原微生物的感染中起著重要作用[1-2, 7]。然而新生兒粒細(xì)胞存在數(shù)量不足以及功能缺陷，這是導(dǎo)致新生兒細(xì)菌性敗血癥死亡的主要因素之一[3-4]。

表2臍血與成人外周血粒細(xì)胞TLR2和TLR4的平均蛋白熒光強(qiáng)度

Table 2. The mean protein fluorescence intensity of TLR2 and TLR4 in granulocytes from umbilical cord blood and adult peripheral blood (mean±SD)

GroupnTLR2TLR4Neonate1721.40±3.09*23.04±4.11Adult1330.50±5.6929.16±5.81

*P<0.05vsadult group.

我們采用隨機(jī)抽取法從華僑醫(yī)院婦產(chǎn)科收集17例正常足月新生兒的臍血和13例正常成人自愿者外周血，按指引提取合格粒細(xì)胞并提取RNA和合成cDNA后進(jìn)行各基因檢測(cè)分析。所用的RT-PCR引物經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，Vector NTI比對(duì)分析驗(yàn)證證實(shí)合格，保證后續(xù)RT-qPCR分析臍血與成人外周血粒細(xì)胞TLRs家族成員的基因表達(dá)情況的可信性。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)粒細(xì)胞TLR2和TLR4的平均蛋白熒光強(qiáng)度，有效避免因細(xì)胞蛋白提取過(guò)程中目標(biāo)蛋白丟失而產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)誤差。

TLRs是天然免疫受體超家族中一個(gè)極其重要的受體家族，表達(dá)于多種類型的組織細(xì)胞，能夠識(shí)別病原相關(guān)分子模式，啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答，清除病原體并指導(dǎo)和調(diào)控獲得免疫。已知人類體細(xì)胞共存在10個(gè)TLRs家族成員，部分成員參與免疫細(xì)胞的調(diào)控[1, 10]。中性粒細(xì)胞上的TLRs與PAMPs及內(nèi)源性配體結(jié)合后，可激活天然免疫反應(yīng)，介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)，直接殺傷入侵病原微生物[8]。研究發(fā)現(xiàn)新生兒胎齡越小，其臍血單個(gè)核細(xì)胞TLR2和TLR4水平越低，推測(cè)可能是新生兒天然免疫能力低下，易患細(xì)菌性敗血癥等嚴(yán)重感染性疾病的重要原因[11]。林桃等[12]研究顯示在新生兒敗血癥中隨著C反應(yīng)蛋白升高，其外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR2同步升高，兩者呈正相關(guān)，且均與發(fā)病的早晚有關(guān)。Wu等[13]發(fā)現(xiàn)TLR4在新生兒窒息導(dǎo)致腎臟缺血再灌注損傷時(shí)所激發(fā)的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。且 TLR4 的異常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是壞死性小腸結(jié)腸炎分子發(fā)病機(jī)制之一[14]。Liu等[15]研究表明當(dāng)新生兒發(fā)生壞死性小腸結(jié)腸炎時(shí)，所有的 TLRs 均在 48 h內(nèi)發(fā)生變化，早于小腸結(jié)腸的組織形態(tài)學(xué)變化。上述報(bào)道均以臍血單個(gè)核細(xì)胞或組織中的TLRs為研究對(duì)象，探討其表達(dá)變化與新生兒并發(fā)癥的關(guān)系。由于常用密度梯度離心法分離所得單個(gè)核細(xì)胞主要為T、B淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞的混合體，且臍血單個(gè)核細(xì)胞的情況更為復(fù)雜，除淋巴、單核細(xì)胞外，還包含造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等幼稚的細(xì)胞組分[16-17]。已知這些細(xì)胞均可表達(dá)不同的TLRs家族成員[18-19]，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)判存在一定的干擾。新生兒以T、B淋巴細(xì)胞為主的獲得免疫體系相對(duì)于以粒細(xì)胞為主的天然免疫體系更為幼稚[1]。天然免疫是新生兒機(jī)體首要的或關(guān)鍵的屏障，與新生兒的健康休戚相關(guān)。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們以臍血粒細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)密度梯度離心結(jié)合紅細(xì)胞溶解獲取較高純度的粒細(xì)胞，較少的淋巴細(xì)胞污染，較好地規(guī)避造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等幼稚細(xì)胞的干擾，分析粒細(xì)胞整個(gè)Toll樣受體家族表達(dá)的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLRs所有家族成員基因的表達(dá)，無(wú)論在臍血還是成人外周血粒細(xì)胞均存在個(gè)體差異。TLR1、TLR2、TLR4和TLR6 mRNA在新生兒粒細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于成人外周血粒細(xì)胞；且TLR2和TLR4蛋白表達(dá)檢測(cè)與Viemann等[20]檢測(cè)結(jié)果一致，顯示新生兒粒細(xì)胞TLR2表達(dá)低于成人，而TLR4差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TLR2 能和TLR1或TLR6結(jié)合形成異質(zhì)二聚體，可識(shí)別一部分革蘭陽(yáng)性細(xì)菌的脂蛋白和磷壁酸、分支桿菌細(xì)胞壁、鉤端螺旋體的脂多糖LPS、酵母菌細(xì)胞壁以及少見的脂多糖等類配體[21]，它們的低下是否正是新生兒粒細(xì)胞不能全面和迅速地識(shí)別并清除上述病原體，從而導(dǎo)致病菌在血液中大量繁殖引起新生兒細(xì)菌性敗血癥的內(nèi)在因素有待進(jìn)一步探討；TLR3、TLR7、 TLR8和TLR9表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)，主要是對(duì)病毒核酸的監(jiān)測(cè)和識(shí)別，TLR3 識(shí)別雙鏈RNA，而TLR7和TLR8 識(shí)別單鏈RNA，TLR9識(shí)別未甲基化的CG輔酶Ⅰ(CpG 序列)，調(diào)節(jié)細(xì)菌DNA 和某些病毒的反應(yīng)[22-23]。我們的結(jié)果顯示TLR3、TLR7和TLR9 mRNA在臍血與成人外周血粒細(xì)胞中均低表達(dá)，而Prince等[8]發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞不表達(dá)TLR3和TLR7。低豐度的TLR3 和TLR7 mRNA是樣本中殘存的T、B細(xì)胞所致[18]，還是粒細(xì)胞表達(dá)低下？ 以及TLR3、TLR7和TLR9 mRNA的低表達(dá)是否與粒細(xì)胞主要針對(duì)細(xì)菌性病原微生物入侵的天然特性有關(guān)，有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)臍血粒細(xì)胞與細(xì)菌性病原微生物成分識(shí)別相關(guān)的TLR1、TLR2、TLR4和TLR6 mRNA及TLR2蛋白表達(dá)低于成人外周血粒細(xì)胞，與新生兒，尤其是早產(chǎn)兒急性細(xì)菌性毒血癥發(fā)病及病死率較高的臨床表現(xiàn)一致，為新生兒相關(guān)疾病的臨床治療積累了實(shí)驗(yàn)資料。因本實(shí)驗(yàn)分離的粒細(xì)胞中仍殘存約5%的T細(xì)胞，仍有進(jìn)一步提高樣本細(xì)胞純度的空間，以明確TLR3和TLR7 mRNA的表達(dá)情況。

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ComparisonofToll-likereceptorexpressioningranulocytesfromumbilicalcordbloodandadultperipheralblood

LIU Jun1, WU Xia2, CHEN Zhi-cong1, LIAO Ji-dong1, GU Jing-yi1, YANG Xiao-lei1, LIU Guo-sheng2, WU Hui2, LI Yang-qiu3

(1TinKa-pingCenterforMedicalExperiments,SchoolofMedicine,2theFirstClinicalHospital,3InstituteofHematology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tliaojd@jnu.edu.cn)

AIM: To compare the expression levels of Toll-like receptors (TLRs) in the granulocytes isolated from umbilical cord blood and adult peripheral blood.METHODSThe granulocytes in umbilical blood and adult peri-pheral blood were isolated by the method of density gradient centrifugation combined with red blood cell splitting. The purity of the cells was evaluated by flow cytometry. The mRNA expression levels of 10 TLRs were detected by RT-qPCR, and the protein levels of some TLRs were also tested by flow cytometry.RESULTSThe populations of CD19-CD24+cells and CD3+cells were (95.66±3.15)% and (4.19±1.54)% in neonatal granulocytes,respectively, and were (95.36±1.74)% and (4.30±0.96)% in adult granulocytes,respectively. The relative mRNA expression levels of TLRs in the granulocytes isolated from umbilical cord blood and adult peripheral blood were as follows: TLR1 0.141±0.091 and 0.691±0.447, TLR2 0.388±0.337 and 0.901±0.508, TLR4 0.093±0.071 and 0.254±0.147, TLR6 0.056±0.045 and 0.202±0.034, TLR7 0.001±0.001 and 0.004±0.003, and TLR8 0.046±0.040 and 0.211±0.146,and the diffe-rence had statistical significance (P<0.01). However, no difference in the expression levels of TLR3, TLR5, TLR9 and TLR10 between the neonatal and adult gra-nulocytes was observed (P>0.05). Among them, the mRNA expression of TLR3, TLR7 and TLR9 was at a low level in both neonatal and adult granulocytes. The protein level of TLR2 in adult gra-nulocytes (30.50±5.69) was higher than that in neonatal granulocytes (21.40±3.09,P<0.05).CONCLUSIONLow mRNA expression of TLR1, TLR2, TLR4 and TLR6, and low protein level of TLR2 in neonatal granulocytes indicate that the ability of recognizing bacterial pathogen by neonatal granulocytes may be defective or not yet fully mature.

Neonate; Umbilical cord blood; Granulocyte; Toll-like receptors; Gene expression

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.018

1000- 4718(2013)04- 0676- 06

2012- 12- 29

2013- 02- 26

廣東省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)資金計(jì)劃項(xiàng)目(No.2010B031600107);廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.07005966)

△通訊作者Tel： 020-85225841; E-mail: tliaojd@jnu.edu.cn