人α1-抗胰蛋白酶在胰島β細(xì)胞移植中免疫抑制和保護(hù)作用的研究*

張曉丹， 葉 劍， 廖玉婷， 齊 暉， 鄧春燕， 李富榮

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院干細(xì)胞與細(xì)胞治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518020)

人α1-抗胰蛋白酶在胰島β細(xì)胞移植中免疫抑制和保護(hù)作用的研究*

張曉丹， 葉 劍， 廖玉婷， 齊 暉， 鄧春燕， 李富榮△

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院干細(xì)胞與細(xì)胞治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518020)

目的探討人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)蛋白在胰島β細(xì)胞移植中的免疫抑制和保護(hù)作用。方法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)hAAT蛋白的NIT-hAAT細(xì)胞系。將NIT-1細(xì)胞系和NIT-hAAT細(xì)胞系分別2次腹腔注射正常BALB/c小鼠，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)產(chǎn)生，將絲裂霉素處理后的2種細(xì)胞系與CTL混合培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NIT-hAAT細(xì)胞凋亡情況；ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)炎癥因子mRNA表達(dá)。將2種細(xì)胞系分別植入糖尿病模型小鼠左腎包膜內(nèi)，動(dòng)態(tài)觀察血糖和體重變化、血清中胰島素和C肽水平以及移植部位的病理學(xué)變化。結(jié)果CTL實(shí)驗(yàn)中，NIT-hAAT細(xì)胞受體鼠淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用較NIT-1細(xì)胞受體鼠明顯減輕。hAAT具有減輕細(xì)胞凋亡、抑制炎癥因子IL-1β、IL-6 mRNA的表達(dá)以及調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子平衡的作用。NIT-hAAT細(xì)胞移植到糖尿病模型小鼠后，血糖明顯下降并維持至28 d，血清中胰島素和C肽含量明顯升高，移植部位炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。結(jié)論hAAT蛋白可減輕CTL對(duì)β細(xì)胞的殺傷作用，抑制炎癥因子的表達(dá)，短期內(nèi)可以抑制移植物免疫排斥反應(yīng)，對(duì)胰島β細(xì)胞移植治療糖尿病具有明顯的免疫抑制和保護(hù)作用。

α1-抗胰蛋白酶； β細(xì)胞； 移植； 免疫抑制； 糖尿病

受移植后炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的移植物破壞與凋亡、免疫抑制劑使用導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能損害以及自身免疫作用等多種因素的影響，胰島移植5年后胰島素脫離率只有10%[1-4]。因此，自身免疫和免疫排斥是目前胰島移植需重點(diǎn)解決的問(wèn)題。

α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，AAT)是體內(nèi)重要的絲氨酸蛋白酶抑制劑[5]，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，AAT不但能夠抑制血清中的各種酶，包括中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、蛋白酶3、凝血酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶，還能通過(guò)抑制細(xì)胞因子、補(bǔ)體活化和免疫細(xì)胞滲透發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)作用[6]。除了抵抗炎癥作用外，AAT還能顯著地降低細(xì)胞因子和鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)對(duì)胰島β細(xì)胞的凋亡作用[7-8]。另外，AAT治療能夠顯著延長(zhǎng)移植的胰島在受體小鼠體內(nèi)存活時(shí)間[9]，并誘導(dǎo)特異性免疫耐受[10]。本研究旨在將人源AAT基因?qū)胄∈笠葝uβ細(xì)胞(NIT-1細(xì)胞)，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人AAT蛋白的NIT-1細(xì)胞系(NIT-hAAT)，探討人AAT(human AAT,hAAT)對(duì)移植的β細(xì)胞是否具有免疫抑制和保護(hù)作用。

材 料 和 方 法

1材料

穩(wěn)定表達(dá)hAAT基因的pBS-RSV-hAAT質(zhì)粒由美國(guó)華盛頓大學(xué)Andre Lieber教授惠贈(zèng)。真核表達(dá)載體pDsRed-N111由北京大學(xué)深圳研究生院盧志剛教授惠贈(zèng)。NIT-1細(xì)胞系由中山大學(xué)李芳萍教授惠贈(zèng)。BALB/c小鼠，20周齡，雌雄各半，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供給。

2試劑

胎牛血清(Gibco)；DMEM培養(yǎng)基(Sigma)；LipofectamineTM2000(Invitrogen)；G418(Sigma)；小鼠干擾素γ(interferon γ,IFN-γ)和白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4)ELISA檢測(cè)試劑盒(Neobioscience)；總RNA提取試劑盒(Gibco)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(MBI)；C-肽水平ELISA檢測(cè)試劑盒(Mercodia)。

3方法

3.1NIT-hAAT細(xì)胞系的構(gòu)建和鑒定 將PCR擴(kuò)增的hAAT基因亞克隆至真核表達(dá)載體pDsRed-N111的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建pDsRed-hAAT質(zhì)粒。用含10%FCS的DMEM培養(yǎng)基在24孔板中擴(kuò)增NIT-1細(xì)胞系。用LipofectamineTM2000將pDsRed-hAAT轉(zhuǎn)染至NIT-1細(xì)胞，72 h后向培養(yǎng)基中加入G418(350 mg/L)進(jìn)行篩選，之后用低劑量G418(175 mg/L)對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行篩選，最終獲得的穩(wěn)定傳代的細(xì)胞株即NIT-hAAT細(xì)胞系。取第10代和第40代NIT-hAAT細(xì)胞系，Western blotting檢測(cè)hAAT蛋白的表達(dá)。

3.2CTL實(shí)驗(yàn) 取40只BALB/c小鼠，分別在第1 d腹腔注射5×106個(gè)NIT-1或NIT-hAAT細(xì)胞后，第10 d重復(fù)注射等量同種細(xì)胞。另20只BALB/c小鼠腹腔注射生理鹽水，作為空白對(duì)照組。第20 d處死各組小鼠，取脾臟研磨，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2次，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，備用。

3.3單向混合淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) CTL實(shí)驗(yàn)中各組淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞。將NIT-1和NIT-hAAT細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至5×105左右時(shí)，每孔加入1～1.5 mL絲裂霉素(30 g/L)，避光處理30 min，作為刺激細(xì)胞，進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction，MLR)。反應(yīng)細(xì)胞與刺激細(xì)胞之比分別為5∶1、10∶1、20∶1及50∶1，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)72 h，加入CCK-8試劑(10 μL/well)，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度(A)。依下列公式計(jì)算刺激細(xì)胞的刺激指數(shù)(stimulation index,SI)=(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(陰性對(duì)照孔A值-空白孔A值)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置相應(yīng)的陰性對(duì)照及空白對(duì)照孔。

3.4炎癥細(xì)胞因子檢測(cè) 取CTL實(shí)驗(yàn)中各組5×106個(gè)淋巴細(xì)胞與絲裂霉素處理的NIT-1或NIT-hAAT細(xì)胞，按10∶1混合培養(yǎng)7 d后，獲取培養(yǎng)上清，-80 ℃保存待用。小鼠IFN-γ和IL-4 ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子含量，450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞因子含量。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 CTL實(shí)驗(yàn)中各組5×106個(gè)淋巴細(xì)胞與絲裂霉素處理的NIT-1或NIT-hAAT細(xì)胞，按10∶1混合培養(yǎng)7 d后，棄去懸浮的淋巴細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化并收集NIT-1或NIT-hAAT細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，取100 μL細(xì)胞懸液分別加入5 μL Annexin V-FITC和1 μL PI 混勻，避光孵育30 min，PBS洗滌2次，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況。

3.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)炎癥因子C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá) CTL實(shí)驗(yàn)中各組5×106個(gè)淋巴細(xì)胞與絲裂霉素處理的NIT-1或NIT-hAAT細(xì)胞，按10∶1混合培養(yǎng)7 d后，收集淋巴細(xì)胞，提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按Revert-AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)操作。

熒光定量PCR反應(yīng)體系50 μL，PCR擴(kuò)增條件為: 93 ℃ 3 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 10 min 。每個(gè)樣本同時(shí)設(shè)置3個(gè)平行管，β-actin作為內(nèi)參照，LightCycler Software 4.05分析計(jì)算結(jié)果,得到cDNA拷貝數(shù)(copies/μL)，結(jié)果分析采用目的基因分子拷貝數(shù)/β-actin分子拷貝數(shù)，計(jì)算K值。以取材時(shí)間為橫坐標(biāo)，各基因相應(yīng)K值作折線圖，分析其表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

3.7小鼠糖尿病模型的制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)3～5 d后，將BALB/c小鼠禁食12 h，腹腔注射2% STZ溶液(170 mg/kg)，以高糖/高脂喂養(yǎng)。72 h后尾靜脈采血監(jiān)測(cè)血糖，連續(xù)3 d血糖濃度大于0.3 g/L的小鼠為造模成功的糖尿病小鼠。

3.8細(xì)胞移植 將BALB/c糖尿病小鼠模型隨機(jī)分為3組：(1)NIT-hAAT組(n=10)：左腎包膜下注射1.5×107個(gè)NIT-hAAT細(xì)胞；(2)NIT-1組(n=10)：左腎包膜下注射1.5×107個(gè)NIT-1細(xì)胞；(3)對(duì)照組(n=10)：左腎包膜下注射PBS 0.1 mL。

3.9移植后功能學(xué)檢測(cè) 移植后BALB/c小鼠，每天15：00斷尾法取血，MediSenseOptium血糖儀檢測(cè)，紙片法連續(xù)測(cè)定非空腹血糖至36 d。在30 d時(shí)摘取左腎。當(dāng)血糖連續(xù)2 d超過(guò)0.3 g/L 則診斷為糖尿病。在移植后第7、14、21、28 d，各組小鼠眶周采血0.5 mL，離心分離血清-20 ℃保存，采用ELISA法檢測(cè)血清中胰島素和C肽水平。

3.10移植部位病理學(xué)觀察 BALB/c小鼠在細(xì)胞移植后14和28 d，每組各處死3只BALB/c小鼠取移植左腎組織，10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋固定，切成5 μm組織切片，HE染色。400倍光學(xué)顯微鏡下，在移植部位隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)白細(xì)胞浸潤(rùn)個(gè)數(shù)。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。隨時(shí)間檢測(cè)的數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，組間數(shù)據(jù)分析采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析(One-way ANOVA)。兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1NIT-hAAT細(xì)胞系構(gòu)建及hAAT表達(dá)的鑒定

將構(gòu)建的pDsRed-hAAT轉(zhuǎn)染至NIT-1細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后建立穩(wěn)定的NIT-hAAT細(xì)胞系。對(duì)NIT-hAAT細(xì)胞系表達(dá)的hAAT蛋白進(jìn)行Western blotting鑒定。與第10代結(jié)果一致，第40代對(duì)照組NIT-1細(xì)胞只表達(dá)42 kD的β-actin，而NIT-hAAT細(xì)胞同時(shí)表達(dá)β-actin與55 kD的hAAT。這表明構(gòu)建的NIT-hAAT細(xì)胞系在體外傳代至40代，仍能穩(wěn)定表達(dá)hAAT蛋白，見(jiàn)圖1。

Figure 1. hAAT expression confirmed by Western blotting.1:NIT-1 cells transfected with pDsRed-hAAT; 2:NIT-1 cells transfected with pDsRed.

圖1NIT-hAAT表達(dá)hAAT蛋白的Westernblotting分析

2AAT的免疫保護(hù)和免疫抑制作用

2.1單向混合淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 各組淋巴細(xì)胞與絲裂霉素處理的NIT-hAAT或NIT-1細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，NIT-hAAT組淋巴細(xì)胞增殖與NIT-1組相比，受到明顯的抑制(P<0.05)，并隨著NIT-hAAT相對(duì)于淋巴細(xì)胞比例的提高，抑制效果逐漸增強(qiáng)，具有量效關(guān)系，見(jiàn)圖2。當(dāng)10∶1時(shí)，抑制效果呈顯著差異(P<0.01),且NIT-1組較對(duì)照組和NIT-hAAT組淋巴細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.01，P<0.05)。

2.2ELISA檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子 ELISA檢測(cè)各組淋巴細(xì)胞與絲裂霉素處理的NIT-hAAT或NIT-1細(xì)胞10∶1比例共培養(yǎng)上清中Th1細(xì)胞因子(IFN-γ)和Th2細(xì)胞因子(IL-4)水平。結(jié)果顯示，與NIT-1組相比，NIT-hAAT組淋巴細(xì)胞的IFN-γ分泌水平明顯降低(P<0.05)，IL-4分泌水平明顯升高(P<0.05)。而同一種細(xì)胞的移植受體鼠脾細(xì)胞中，IFN-γ和IL-4分泌水平無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表2。

Figure 2. Mixed lymphocyte reactions stimulated by NIT-hAAT and NIT-1 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNIT-1.

圖2NIT-hAAT和NIT-1單向混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

表2單向混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中分泌炎癥細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的水平

Table 2. Comparison of the secretion of IFN-γ and IL-4 in lymphocytes immunized by NIT-1 or NIT-hAAT cells(ng/L.Mean±SD.n=3)

GroupIFN-γ(Th1)IL-4(Th2)NIT-1cell-primedlymphocytesNIT-hAATcell-primedlymphocytesNIT-1cell-primedlymphocytesNIT-hAATcell-primedlymphocytesNIT-1218.29±4.75196.06±1.82*22.80±3.7524.20±4.75*NIT-hAAT41.83±3.46**33.54±5.82**45.40±2.60**52.10±3.25**Control182.01±6.42164.60±5.2328.20±0.8232.20±7.21

*P<0.05,**P<0.01vscontrol or NIT-1.

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)炎癥因子mRNA表達(dá) 與NIT-1細(xì)胞移植受體鼠相比，NIT-hAAT細(xì)胞移植受體鼠脾淋巴細(xì)胞中CRP mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)，而IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)減弱(P<0.05)，見(jiàn)圖3。這表明hAAT可抑制炎癥因子的表達(dá)。

Figure 3. Inflammatory cytokine expression analysed by real-time fluorescence quantitative PCR from aninvitroextended CTL assay. A,C,E:mediated by NIT-1 cell-primed lymphocytes; B,D,F: mediated by NIT-hAAT cell-primed lymphocytes.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNIT-1.

圖3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)炎癥因子mRNA表達(dá)

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 經(jīng)絲裂霉素處理的NIT-1或NIT-hAAT細(xì)胞分別與NIT-1或NIT-hAAT細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL混合培養(yǎng)7 d后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NIT-1細(xì)胞與NIT-1誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)，NIT-1細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡(37.55%±1.05%)；與NIT-hAAT誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)，NIT-1細(xì)胞凋亡發(fā)生率較低(12.94%±0.36%)(P<0.05)。NIT-hAAT細(xì)胞與NIT-1誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)，NIT-hAAT細(xì)胞凋亡明顯降低(10.05%±0.95%)；而與NIT-hAAT誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)，NIT-hAAT細(xì)胞凋亡最低(8.56%±1.34%)(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4. The apoptosis of NIT-1 (A,C) and NIT-1-hAAT (B,D) cells determined by flow cytometric analysis with Annexin V-FITC and PI staining. A, B:mediated by NIT-1 cell-primed lymphocytes; C,D:mediated by NIT-hAAT cell-primed lymphocytes.

圖4流式細(xì)胞術(shù)分析NIT-1或NIT-hAAT細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖

3AAT對(duì)NIT-1細(xì)胞移植后的功能影響

3.1糖尿病模型小鼠血糖和體重變化 糖尿病BALB/c小鼠左腎包膜移植NIT-1或NIT-hAAT細(xì)胞后，每3 d監(jiān)測(cè)1次各組小鼠血糖濃度變化，移植后第3 d兩組小鼠的血糖均迅速降低。NIT-1組在移植12 d后血糖開(kāi)始升高，15 d時(shí)升至0.3 g/L，第30 d摘除左腎后血糖無(wú)明顯變化；NIT-hAAT組小鼠維持正常血糖水平至30 d，在第30 d摘除左腎后血糖迅速升高至糖尿病水平。NIT-hAAT組小鼠體重平緩增加，NIT-1組和糖尿病組小鼠體重逐漸減少，見(jiàn)圖5A。

3.2胰島素和C肽水平 胰島素和C肽水平方面，NIT-hAAT組小鼠移植3 d后開(kāi)始明顯升高，并維持在較高水平，較糖尿病組小鼠升高顯著(P<0.01)。NIT-1組小鼠在移植后第3 d開(kāi)始明顯升高并持續(xù)至第14 d，之后胰島素和C肽水平逐漸降低，第21 d時(shí)與糖尿病組相比無(wú)明顯區(qū)別，見(jiàn)圖5B、C。

4病理學(xué)觀察

NIT-1組移植后14 d時(shí)只殘存少量移植細(xì)胞，浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞數(shù)量為(31.0±1.0)，28 d時(shí)未見(jiàn)移植細(xì)胞，組織呈纖維化改變。NIT-hAAT組在移植后14 d時(shí)有大部分移植細(xì)胞存活，浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞數(shù)量為(14.0±2.9)，明顯低于NIT-1組(P<0.01)，28 d后NIT-hAAT組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(16.0±3.6)與14 d無(wú)明顯變化，仍有移植細(xì)胞存活，見(jiàn)圖6。

Figure 5. Changes of blood glucose (A), insulin (B) and C-peptide (C) levels in diabetic mice after transplantation. Mean±SD. Ten mice were used in monitoring blood sugar level. Five mice were used in determination of C-peptide and insulin secretion.*P<0.05vsdiabetes.

圖5糖尿病小鼠移植NIT-1或NIT-hAAT細(xì)胞后血糖、胰島素和C-肽水平的變化

討 論

NIT-1是一種能自主分泌胰島素的NOD鼠源β細(xì)胞系，是研究1型糖尿病的常用細(xì)胞模型[11]。本研究中將AAT基因?qū)隢IT-1，構(gòu)建NIT-hAAT細(xì)胞系，經(jīng)Western blotting方法證實(shí)，NIT-hAAT細(xì)胞系在體外擴(kuò)增培養(yǎng)至40代后仍具有良好的自我增殖和分泌hAAT的能力。在體外CTL實(shí)驗(yàn)中，將NIT-hAAT和NIT-1細(xì)胞分別與NIT-hAAT和NIT-1細(xì)胞刺激的同種異體BALB/c小鼠CTL共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NIT-hAAT細(xì)胞對(duì)CTL的刺激增殖作用明顯低于NIT-1細(xì)胞。與NIT-1組相比，NIT-hAAT組CTL的Th1(IFN-γ)分泌水平明顯降低(P<0.05)，Th2(IL-4)分泌水平明顯升高。與NIT-1細(xì)胞移植受體小鼠相比，NIT-hAAT細(xì)胞移植受體鼠CTL中CRP mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)，而炎癥因子IL-1β、IL-6mRNA的表達(dá)減弱(P<0.05)。NIT-hAAT細(xì)胞與NIT-hAAT誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL混合培養(yǎng)時(shí)，NIT-hAAT細(xì)胞凋亡最低(P<0.05)。通過(guò)CTL實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hAAT具有保護(hù)NIT-1細(xì)胞的作用，可能通過(guò)與IL-1β和IFN-γ結(jié)合抑制對(duì)β細(xì)胞破壞[12]；也可能在β細(xì)胞內(nèi)通過(guò)抑制caspase-3活化直接發(fā)揮抗凋亡作用[7]；或通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡發(fā)揮作用。IL-4屬于Th2型細(xì)胞因子，可以促進(jìn)Th0向Th2分化，抑制Th0向Th1分化，NIT-hAAT細(xì)胞能夠促進(jìn)IL-4的產(chǎn)生。因此推測(cè)，AAT可能誘導(dǎo)Th2細(xì)胞的產(chǎn)生，分泌過(guò)量的IL-4，進(jìn)而下調(diào)Th1細(xì)胞因子的殺傷能力，同時(shí)抑制炎癥因子的基因表達(dá)。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，NIT-hAAT細(xì)胞與NIT-hAAT細(xì)胞介導(dǎo)的CTL共培養(yǎng)時(shí)，NIT-hAAT細(xì)胞凋亡率最低，與NIT-1細(xì)胞介導(dǎo)的CTL共培養(yǎng)，NIT-hAAT細(xì)胞凋亡率也明顯降低，表明AAT可能通過(guò)免疫保護(hù)和免疫抑制發(fā)揮雙重作用。

Figure 6. The pathological changes of mouse left kidneys after transplantation (HE staining).A,B:14 d after transplantation;C,D:21 d after transplantation; A,C: NIT-1 group; B,D: NIT-hAAT group. Scale bar=200 μm.

圖6糖尿病小鼠移植部位病理學(xué)分析

糖尿病模型鼠的移植實(shí)驗(yàn)中，將NIT-hAAT細(xì)胞移植到糖尿病小鼠左腎[13]，血糖在移植3 d后明顯降低，維持至30 d，左腎摘除后血糖迅速升高成為高血糖癥；而NIT-1細(xì)胞移植組小鼠血糖在移植3 d后降低，12 d后即開(kāi)始迅速升高。我們同時(shí)觀察到，在14、21和28 d時(shí)NIT-hAAT組小鼠血清胰島素和C肽水平較糖尿病組和NIT-1組小鼠明顯升高(P<0.05)。張悅等[14]同樣證實(shí)，AAT可提高NIT-1細(xì)胞生存能力和減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生。我們先前將NIT-hAA移植到7周齡雌性NOD鼠左腎包膜下,發(fā)現(xiàn)NIT-hAAT移植后NOD鼠糖尿病的發(fā)生時(shí)間明顯推遲，發(fā)病率明顯降低；胰腺炎減輕，胰島細(xì)胞凋亡減少，移植部位炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少, hAAT具有抑制移植物免疫排斥反應(yīng)和抑制自身免疫攻擊的雙重作用[12]。Lewis等[15]在胰島移植實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，AAT可阻斷中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞對(duì)移植物的浸潤(rùn)，在移植物周圍形成袖口狀T調(diào)節(jié)細(xì)胞層，這些細(xì)胞表達(dá)Foxp3、TGF-β、CTLA-4等T調(diào)節(jié)細(xì)胞相關(guān)蛋白；Walters等[16]也在移植物周圍發(fā)現(xiàn)類似的保護(hù)細(xì)胞層，從而減少移植物的炎癥浸潤(rùn)，延長(zhǎng)存活時(shí)間。由于胰島素瘤細(xì)胞系來(lái)自NOD/Lt小鼠，移植后會(huì)發(fā)生免疫排斥，NIT-hAAT細(xì)胞表達(dá)的hAAT蛋白能夠抑制對(duì)胰島細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)，并表現(xiàn)出免疫保護(hù)作用；通過(guò)上調(diào)IL-4的分泌，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的平衡，抑制免疫反應(yīng)發(fā)生，減輕胰島β細(xì)胞移植中的免疫排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)胰腺β細(xì)胞在小鼠體內(nèi)存活期。NIT-hAAT在體內(nèi)如何發(fā)揮免疫抑制和免疫保護(hù)的作用機(jī)制，以及是否具有誘導(dǎo)免疫耐受，維持長(zhǎng)久移植的胰島細(xì)胞存活，還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建攜帶免疫調(diào)節(jié)功能元件hAAT的胰島β細(xì)胞構(gòu)建NIT-hAAT細(xì)胞系。通過(guò)單向混合淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，證實(shí)hAAT對(duì)胰島細(xì)胞具有雙重免疫保護(hù)作用。將NIT-hAAT移植到糖尿病小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)NIT-hAAT能夠在體內(nèi)發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，短期內(nèi)可以抑制移植物免疫排斥反應(yīng)。

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Immunosuppressiveandprotectiveeffectsofhumanα1-antitrypsinonpancreaticβ-celltransplantation

ZHANG Xiao-dan, YE Jian, LIAO Yu-ting, QI Hui, DENG Chun-yan, LI Fu-rong

(KeyLaboratoryofStemCellandCellularTherapy,theSecondClinicalMedicalCollege,ShenzhenPeople’sHospital,JinanUniversity,Shenzhen518020,China.E-mail:frli62@yahoo.com)

AIM: To study the immunosuppressive and protective effects of human α1-antitrypsin (hAAT) on pancreatic β-cell transplantation.METHODSAn NIT-1 cell line (NIT-hAAT) was constructed, which can stably express the protein of hAAT. The BALB/c mice were intraperitoneally injected with NIT-1 and NIT-hAAT cell lines twice to induce cytotoxic T-lymphocytes (CTL). The apoptotic situation, the cytokine expression, and the mRNA expression of inflammatory factors were examined after mixed culture of CTL with NIT-1 or NIT-hAAT cell line pretreated with mitomycin. Both cell lines were transferred into the left renal capsule of the diabetic mice to dynamically observe the changes of blood sugar and body weight, the serum levels of insulin and C-peptide, and the pathological changes of the transplanted sites.RESULTSThe results of extended CTL killing assay showed that the cytotoxic effect on NIT-hAAT cell acceptor mice was significantly reduced compared with NIT-1 cell acceptor mice. hAAT effectively reduced apoptosis, inhibited the mRNA expression of inflammatory factors IL-1β and IL-6, and adjusted the balance of Th1/Th2 cytokine expression. After NIT-hAAT was transplanted into the diabetic mice, blood glucose decreased obviously and maintained for 28 d. The serum levels of insulin and C-peptide increased obviously. The infiltration of the inflammatory cells in the transplanted sites significantly reduced.CONCLUSIONhAAT has the abilities of reducing cytotoxic effect of CTL on the β-cells, inhibiting inflammatory factor expression, and stopping short-term immunological rejection of the acceptor. hAAT has obvious immunosuppressive and protective effects on pancreatic β-cell transplantation for treatment of diabetes.

α1-antitrypsin; β-cells; Transplantation; Immunosuppression; Diabetes mellitus

R392.11

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.008

1000- 4718(2013)04- 0619- 07

2013- 01- 14

2013- 03- 11

國(guó)家973前期專項(xiàng)(No. 2007CB516811)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81270857)；深圳市科技計(jì)劃(No. 200901001)

△通訊作者 Tel: 0755-25533018-2450; E-mail: frli62@yahoo.com