microRNA-21轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞移植對低溫條件下心力衰竭大鼠的影響*

唐 艷， 王夢洪

(1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江西 南昌330006; 2南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

·論著·

microRNA-21轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞移植對低溫條件下心力衰竭大鼠的影響*

唐 艷1,2， 王夢洪1△

(1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江西 南昌330006;2南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

目的探討microRNA-21對低溫條件下心力衰竭大鼠的影響。方法利用阿霉素及氣候箱建立常/低溫條件下心力衰竭大鼠模型,以心功能、心肌組織凋亡率及病理改變作為建模成功的觀察指標(biāo)。采用定量熒光PCR(qRT-PCR)檢測各組心肌組織microRNA-21的表達(dá)。體外培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞,標(biāo)記BrdU,構(gòu)建過表達(dá)microRNA-21的重組慢病毒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞。建模成功后將低溫條件下心力衰竭的大鼠隨機(jī)分為3組,分別注射轉(zhuǎn)染了過表達(dá)microRNA-21的重組慢病毒表達(dá)載體的心肌細(xì)胞 (I組)、單純心肌細(xì)胞 (II組)和DMEM培養(yǎng)基 (III組)。超聲心動圖檢測各組心功能。處死大鼠,留取心臟標(biāo)本進(jìn)行HE病理染色及免疫組化檢測。結(jié)果低溫條件下心力衰竭大鼠(d組)的心功能低于常溫條件下心力衰竭大鼠(c組);c組明顯低于常溫條件下正常大鼠(a組)。a組的心功能與低溫條件下正常大鼠(b組)無明顯差異。d組的心肌組織凋亡率高于c組;c組明顯高于a組。a組的心肌組織凋亡率與b組無明顯差異。microRNA-21在c組心肌組織中的表達(dá)低于a組;microRNA-21在d組心肌組織中的表達(dá)低于c組; microRNA-21在b組心肌組織中的表達(dá)低于a組;Ⅰ組microRNA-21的表達(dá)高于Ⅱ組(P<0.05);超聲檢測心功能提示I組和II組的心功能障礙輕于III組(P<0.05),尤以I組更顯著(P<0.05);免疫組化檢測顯示,移植的心肌細(xì)胞在移植區(qū)存活;HE染色顯示I組和II組的心力衰竭病理變化比Ⅲ組明顯減輕(P<0.05),尤以I組更顯著(P<0.05)。結(jié)論心肌細(xì)胞移植于低溫條件下心力衰竭大鼠能改善心功能,減輕心肌組織的心衰病理變化，其中microRNA-21轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞后移植效果更顯著,為microRNA-21未來診斷及治療低溫條件下心力衰竭提供了新思路。

心力衰竭; 心肌細(xì)胞; MicroRNA-21; 移植

隨著環(huán)境的變化,惡劣氣候等自然災(zāi)害已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康重要因素,對于已有基礎(chǔ)心臟疾病的患者,惡劣環(huán)境是導(dǎo)致患者死亡的主要因素之一。Feldman等[1]在1990～1998年期間對加拿大魁北克和法國充血性心衰患者的季節(jié)性病死率和住院率進(jìn)行了隊(duì)列分析,發(fā)現(xiàn)每年1月的病死率和住院率最高,9月最低,呈現(xiàn)明顯季節(jié)性變化趨勢。Sun等[2]發(fā)現(xiàn)低溫能通過增強(qiáng)交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性從而觸發(fā)多種心血管并發(fā)癥如中風(fēng)、心肌梗死、心衰等的發(fā)生。然而,目前對低溫條件下心力衰竭的概念一直不是很清晰,關(guān)于其病理生理分子機(jī)制和診治的研究迄今為止在國內(nèi)外仍未正式開展。

MicroRNA是真核生物中一種長度約為22個(gè)核苷酸大小、參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼單鏈小分子RNA,可特異性識別靶mRNA的3’-非編碼區(qū)(3’-UTR)并與之結(jié)合,從而降解靶mRNA,抑制翻譯,發(fā)揮其對基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控,調(diào)節(jié)重要的細(xì)胞活動,參與眾多心血管疾病的病理生理過程[3-4]。迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上千余種microRNA,其中microRNA-21在許多心血管疾病如心肌梗死[5]、心力衰竭[6]、心臟肥大中呈差異性表達(dá),參與多種心血管疾病的病理生理分子機(jī)制。近年來研究發(fā)現(xiàn)外界溫度的變化可能影響microRNA-21的表達(dá)。Biggar等[7]發(fā)現(xiàn)冰凍(-3 ℃,24 h)條件下青蛙肝臟和骨骼肌上microRNA-21的表達(dá)分別是非冰凍(5 ℃,24 h)條件下的1.5倍和1.3倍。Yin等[8]發(fā)現(xiàn)暴露于熱休克狀態(tài)下的小鼠心臟中microRNA-21的表達(dá)明顯上調(diào)。Gammell等[9]通過用生物測序和RT-PCR檢測人類、大鼠和小鼠microRNA的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中有26種microRNA在37 ℃和在31 ℃條件下呈差異性表達(dá),其中microRNA-21在31 ℃明顯上調(diào)。但是microRNA-21是否在低溫條件下的心力衰竭中發(fā)揮重要的作用,目前尚不清楚。

心肌細(xì)胞移植是目前治療心力衰竭的一個(gè)熱門領(lǐng)域,它又稱細(xì)胞心肌成形術(shù)。近年來部分動物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)心肌細(xì)胞移植可以部分地替代凋亡壞死的心肌細(xì)胞而有效改善心功能。然而單純的心肌細(xì)胞移植卻因?yàn)樗拗鞯蛲鍪軗p的心肌組織限制了移植的心肌細(xì)胞的存活與分化,大大降低了移植效率。如果能在心肌細(xì)胞移植的同時(shí),通過某種措施增加某種抗心肌細(xì)胞凋亡因子,勢必能同時(shí)抗宿主心肌細(xì)胞凋亡,提高移植功效,最終恢復(fù)宿主心功能[10]。近年來研究發(fā)現(xiàn),microRNA-21是許多心血管疾病中的一個(gè)抗凋亡因子[11]。如果將能夠過表達(dá)microRNA-21的心肌細(xì)胞移植于受損的心肌組織,理論上一方面能改善宿主心功能,另一方面還有利于移植心肌細(xì)胞的存活和生長分化,防止心室重構(gòu)。本研究基于以上設(shè)想,將慢病毒介導(dǎo)的、過表達(dá)microRNA-21的乳鼠心肌細(xì)胞移植于低溫條件下心力衰竭大鼠的心肌組織中,觀察移植心肌細(xì)胞在宿主心肌組織的存活及對宿主心功能的影響。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 Sprague-Dawley乳鼠數(shù)百只(出生1～3 d), 成年雄性SD大鼠91只, 體重250～270 g, 由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2主要試劑及儀器 阿霉素(Sigma), TUNEL試劑盒(Promega)，氣候箱(青島海爾集團(tuán)公司) , 超聲心動儀(GE), DMEM培養(yǎng)基、新生小牛血清、胰蛋白酶及膠原酶II(Gibco), BrdU及BrdU抗體(Sigma), 過表達(dá)microRNA-21重組慢病毒表達(dá)載體(上海吉?jiǎng)P基因公司), 總RNA提取試劑Trizol(Invitrogen), qRT-PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司), 臺式低溫高速離心機(jī)(Sigma), 定量熒光PCR儀(ABI PRISM 7500), 倒置顯微鏡(Olympus), β-actin鼠抗多克隆抗體(Santa Cruz)。

2方法

2.1心力衰竭動物模型制備及分組 雄性SD大鼠52只, 喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為常溫正常組(a組)、低溫正常組(b組)、常溫心衰組(c組)和低溫心衰組(d組), 每組13只,心衰組采用腹腔注射阿霉素造模, 阿霉素用量為每次2.5 mg/kg,每周星期一和星期四各注射1次，共5周, 常溫正常組和低溫正常組同時(shí)腹腔注射等體積生理鹽水。所有組放在常溫條件下(25～28 ℃)5周, 5周后低溫正常組和低溫心衰組放置于氣候箱中(4 ℃, 3 h; 重復(fù)4 d), 常溫正常組和常溫心衰組仍放置于常溫條件下(25～28 ℃)。最后1 d行心臟彩超檢查及HE組織病理檢測, TUNEL法測心肌凋亡, 熒光定量PCR測心肌組織中microRNA-21的表達(dá)。

2.2超聲心動圖檢查 選用GE vivid7彩色多譜勒超聲診斷儀,高頻探頭(12 MHz),Gain 50 dB,深度2.5 cm。(1) 心力衰竭動物模型：于心力衰竭動物模型造模最后1 d,腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,仰臥固定于木板上,胸部脫毛,接心電圖,取大鼠胸骨旁左室長軸切面測量左室舒張末徑(left ventricular internal dimension at end-diastole, LVIDd)、左室收縮末徑(left ventricular internal dimension at end-systole,LVIDs)、射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction, EF)和縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening, FS)。(2) 用于細(xì)胞移植的低溫條件下心力衰竭動物模型：移植前和移植2周后,用同法檢測各組心功能指標(biāo)。

2.3組織學(xué)檢查 (1) 心力衰竭動物模型: 于心力衰竭動物模型造模最后1 d，超聲檢查完畢后, 戊巴比妥鈉過量麻醉處死大鼠, 取出左室心肌部分, 以10%甲醛固定, 常規(guī)石蠟包埋, 病理切片,將切片用二甲苯脫蠟,乙醇梯度脫水, HE染色, 光鏡下觀察。(2) 用于細(xì)胞移植的低溫條件下心力衰竭動物模型:于移植2周后,用HE染色檢測各組心肌組織的病理變化。

2.4TUNEL法檢測心肌組織凋亡率 實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照TUNEL檢測試劑盒說明書進(jìn)行。取出左室心肌部分、依次按照固定、包埋、切片、脫蠟、封閉、加TUNEL反應(yīng)液孵育、加抗熒光素抗體、DAB顯色、復(fù)染、脫水、封片等步驟進(jìn)行。以不加TdT酶者為陰性對照, 分別以用DNase I(10 mg/L)消化的左心室心肌切片為陽性對照。正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色, 凋亡心肌細(xì)胞核呈棕黃色。每只大鼠(光鏡下)觀察4張切片，每張切片在40倍視野下, 隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野的凋亡細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù), 計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞的百分率, 取其平均值為凋亡指數(shù)(AI)。

2.5組織及細(xì)胞總RNA提取和qRT-PCR檢測 取一定量的組織及細(xì)胞經(jīng)干預(yù)后,依據(jù)產(chǎn)品說明書用Trizol裂解, 氯仿抽提總RNA。MicroRNA及內(nèi)參U6逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成模板cDNA, 條件為37 ℃ 60 min,37 ℃ 60 min,-20 ℃保存。MicroRNA-21引物序列: 上游5’ -CCTGCCTGAGCACCTCGTGC-3’,下游5’ -GACTGTGACGACTACCCCAA-3’。產(chǎn)物片段長度為75 bp, 退火溫度為60 ℃,PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)為40次。以U6為內(nèi)參照,其引物序列:上游5’ -CTCGCTTCGGCAGCACA-3’, 下游5’ -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。產(chǎn)物片段長度為109 bp, 退火溫度為60 ℃, PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)為40次。以上引物均由上海捷瑞生物有限公司合成提供的。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法分析。以20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR, 取2 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物分別與microRNA-21引物和內(nèi)參照U6引物進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為: 94 ℃預(yù)變性2 min, 94 ℃ 20 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s。重復(fù)40次循環(huán)。在ABI PRISM 7500 REAL TIME PCR System上操作反應(yīng), 檢測microRNA-21的相對表達(dá)量。

2.6用于細(xì)胞移植的低溫條件下心力衰竭動物模型制備及分組 雄性SD大鼠39只, 喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為移植轉(zhuǎn)染了lenti-microRNA-21的心肌細(xì)胞組(I組)、移植單純心肌細(xì)胞組(II組)和移植DMEM培養(yǎng)基組(III組), 每組13只, 各組采用腹腔注射阿霉素造模, 阿霉素的量每次2.5 mg/kg, 每周注射2次, 共5周, 各組均放在常溫條件下(25～28 ℃)5周,5周后各組放置于氣候箱中(4 ℃, 3 h; 重復(fù)4 d), 最后1 d行心臟彩超檢查并進(jìn)行細(xì)胞移植。

2.7Lenti-microRNA-21轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞及microRNA-21檢測 原代培養(yǎng)48 h后, 選生長良好的心肌細(xì)胞(貼壁伸展良好、細(xì)胞搏動佳),轉(zhuǎn)染lenti-microRNA-21 (MOI=10,n=3),設(shè)置單純心肌細(xì)胞組(只加培養(yǎng)基,n=3)。2組終末體積用含10%新生牛血清DMEM調(diào)至5 mL,24 h后換液加入含10%新生牛血清DMEM 10 mL, 37℃、5% CO2條件下培養(yǎng),隔天換液。于第5 d(此時(shí)達(dá)到轉(zhuǎn)染高峰)收集心肌細(xì)胞,利用qRT-PCR檢測心肌細(xì)胞中microRNA-21的表達(dá),并進(jìn)行心肌細(xì)胞移植。

2.8移植細(xì)胞的準(zhǔn)備及移植 選生長良好的已轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染lenti-microRNA-21的乳鼠心肌細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,離心后,用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配成2×1010/L的細(xì)胞懸液。移植方法:20%烏拉坦(300 mg/kg,ip)聯(lián)合1.5%戊巴比妥(20 mg/kg,ip)復(fù)合麻醉及呼吸機(jī)支持下,經(jīng)左胸4或5肋間開胸,將100 μL細(xì)胞懸液或DMEM培養(yǎng)基多點(diǎn)斜行注射到大鼠心肌組織中,注射深度約0.5～0.8 mm。關(guān)胸并繼續(xù)飼養(yǎng)2周。術(shù)前24 h及術(shù)后每天予以環(huán)孢菌素A(諾華制藥)5 mg/kg皮下注射抑制免疫排斥反應(yīng),注射3 d左右,青霉素105U/kg皮下注射抗感染,注射3 d。

2.9抗BrdU免疫組化檢查 實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照抗BrdU免疫組化檢測試劑盒說明書進(jìn)行,簡述如下:脫蠟、洗滌,0.5% H2O2室溫孵育封閉,正常馬血清室溫孵育,Ⅰ抗4 ℃孵育過夜,Ⅱ抗孵育45 min，親合素-生物素復(fù)合物(avidin-biotin complex,ABC)室溫孵育60 min，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)和H2O2孵育2～10 min，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析或t檢驗(yàn)比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1實(shí)驗(yàn)動物存活評價(jià)

1.1心力衰竭動物模型 52只大鼠用于制作心力衰竭模型,建模過程中共計(jì)5只死亡,總死亡率9.6%,其中常溫正常組和低溫正常組無一死亡,常溫心衰組死亡2只,死亡率為15.4%,低溫心衰組死亡3只,死亡率為23.1%。

1.2用于細(xì)胞移植的低溫條件下心力衰竭動物模型 39只大鼠用于制作低溫條件下心力衰竭模型,在建立模型過程中共計(jì)9只死亡,總死亡率23%,其中每組的死亡數(shù)目均為3只。存活的30只大鼠入選移植實(shí)驗(yàn)。移植術(shù)后共有6只大鼠死亡,總死亡率20%,其中DMEM培養(yǎng)基移植組死亡3只,死亡率為30%,單純心肌細(xì)胞移植組死亡2只,死亡率為20%,轉(zhuǎn)染了lenti-microRNA-21的心肌細(xì)胞移植組死亡1只,死亡率為10%。

2各組心臟功能的變化

2.1心力衰竭動物模型 與常溫正常組相比,常溫心衰組LVIDd和LVIDs明顯增加(P<0.05), FS明顯降低(P<0.05)。而低溫心衰組相比常溫心衰組LVIDd和LVIDs進(jìn)一步增加(P<0.05), FS和EF進(jìn)一步降低(P<0.05), 提示低溫能惡化心力衰竭的進(jìn)展, 心功能進(jìn)一步降低。低溫正常組的LVIDd、LVIDs、FS和EF與常溫正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

Figure 1. Cardiac functions of heart failure rats in the normal or cold environment detected by echocardiogram. LVIDd: left ventricular internal dimension at end-diastole; LVIDs: left ventricular internal dimension at end-systole; EF: ejection fraction; FS: fractional shortening. Group a: normal rats in the normal environment (n=13); group b: normal rats in the cold environment (n=13); group c: heart failure rats in the normal environment (n=11); group d: heart failure rats in the cold environment (n=10). Mean±SD.#P<0.05vsgroup a;△P<0.05vsgroup c.

圖1心臟彩超檢測正?；虻蜏貤l件下心衰大鼠的心功能

2.2用于細(xì)胞移植的低溫條件下心力衰竭動物模型 細(xì)胞移植后2周, 檢查顯示: I組和Ⅱ組中EF與移植前相比有明顯差別。與III組相比, I組和II組的LVIDd和LVIDs減小(P<0.05), EF和FS增加(P<0.05)。與II組相比, I組EF和FS增加(P<0．05),LVIDd和LVIDs減小(P<0.05)。I組及Ⅱ組移植后較移植前心臟射血功能增加,室壁變厚,心腔變小; III組移植后較移植前室壁運(yùn)動、室壁厚度和心腔大小無差別。上述結(jié)果提示移植單純心肌細(xì)胞組和移植轉(zhuǎn)染了microRNA-21的心肌細(xì)胞組較移植單純DMEM培養(yǎng)基組心功能明顯改善,尤以移植轉(zhuǎn)染了microRNA-21的心肌細(xì)胞組更明顯，見圖2和表1。

Figure 2. Cardiac functions of heart failure rats in the cold environment before and 2 weeks after cardiomyocyte transplantation detected by echocardiogram. Group I: transplanted with microRNA-21-transfected cardiomyocytes; group II: transplanted with untransfected cardiomyocytes; group III: transplanted with DMEM.

圖2心臟彩超檢測心肌細(xì)胞移植前和移植2周后低溫心衰大鼠的心功能

表1低溫心衰大鼠心肌細(xì)胞移植前和移植2周后心功能各指標(biāo)的變化

Table 1. The changes of cardiac functions of heart failure rats in the cold environment before and 2 weeks after cardiomyocyte transplantation (mean±SD)

ParameterGroupnBeforetransplantationAftertransplantationΔ(after-before)LVIDd(mm)I95.58±0.124.72±0.18*-0.86±0.15#△II85.61±0.164.99±0.11*-0.62±0.14#III75.64±0.135.52±0.17-0.12±0.15LVIDs(mm)I93.87±0.162.71±0.12*-1.16±0.14#△II83.92±0.122.99±0.14*-0.93±0.13#III73.90±0.193.89±0.18-0.01±0.18EF(%)I962.28±1.1878.11±1.01*15.83±1.09#△II862.14±1.2372.02±1.22*9.88±1.22#III762.19±1.0561.16±1.17-1.03±1.12FS(%)I929.12±1.2135.36±1.51*6.64±1.37#△II828.87±1.1434.16±1.45*5.29±1.30#III729.31±1.0229.34±1.130.08±1.01

LVIDd: left ventricular internal dimension at end-diastole; LVIDs: left ventricular internal dimension at end-systole; EF: ejection fraction; FS: fractional shortening. Group I: transplanted with microRNA-21-transfected cardiomyocytes; group II: transplanted with untransfected cardiomyocytes; group III: transplanted with DMEM.*P<0.05vsbefore transplantation;#P<0.05vsgroup III;△P<0.05vsgroup II.

3各組心肌組織的病理表現(xiàn)

3.1心力衰竭動物模型 光鏡下可見常溫條件下正常組和低溫條件下正常組心肌細(xì)胞形態(tài)、胞質(zhì)、間質(zhì)及橫(縱)紋均為正常；常溫條件下心力衰竭組存在心肌細(xì)胞橫(縱)紋不清, 部分區(qū)域肌質(zhì)纖維溶解, 胞漿空泡變性, 不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤和間質(zhì)水腫病變表現(xiàn)；低溫條件下心力衰竭組的病變較常溫條件下心力衰竭組明顯嚴(yán)重,見圖3。

3.2用于細(xì)胞移植的低溫條件下心力衰竭動物模型 病理切片HE染色顯示植入的心肌細(xì)胞體積較小, 核漿比例明顯增大, 表現(xiàn)出幼稚細(xì)胞的特征。I組和II組較III組病理改變(肌質(zhì)纖維溶解、胞漿空泡變性、炎癥細(xì)胞浸潤和間質(zhì)水腫病變)明顯減輕,尤以I組減輕得更明顯, 提示移植單純心肌細(xì)胞組和移植轉(zhuǎn)染了microRNA-21的心肌細(xì)胞組較移植DMEM培養(yǎng)基組心肌病理改變明顯改善,尤以移植轉(zhuǎn)染了microRNA-21的心肌細(xì)胞組更明顯，見圖4。

4TUNEL檢測各組心肌組織的凋亡率

光鏡下常溫條件下正常組和低溫條件下正常組偶見TUNEL陽性細(xì)胞,常溫條件下心力衰竭組可見明顯TUNEL染色陽性細(xì)胞, 低溫條件下心力衰竭組可見更多TUNEL染色陽性細(xì)胞,見圖5。常溫條件下心力衰竭組和低溫條件下心力衰竭組凋亡指數(shù)分別為28.79±3.10和23.56±2.20, 均顯著高于常溫條件下正常組和低溫條件下正常組的3.56±1.21和4.21±0.88(P<0.05), 常溫條件心衰組凋亡指數(shù)又顯著低于低溫條件下心力衰竭組(P<0.05)。常溫條件下正常組和低溫條件下正常組凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。上述結(jié)果提示常溫正常組和低溫正常組無明顯心肌組織凋亡,常溫心衰組心肌凋亡明顯,低溫心衰組心肌凋亡更明顯。

Figure 3. Pathological changes of myocardial tissues from heart failure rats in the normal or cold environment (HE staining, scale bar=20 μm). Group a: normal rats in the normal environment; group b: normal rats in the cold environment; group c: heart failure rats in the normal environment; group d: heart failure rats in the cold environment.

圖3HE染色檢測正常或低溫條件下心衰大鼠心肌組織的病理變化

Figure 4. Pathological changes of myocardial tissues from heart failure rats in the cold environment 2 weeks after cardiomyocyte transplantation (HE staining, scale bar=20 μm). Group I: transplanted with microRNA-21-transfected cardiomyocytes; group II: transplanted with untransfected cardiomyocytes; group III: transplanted with DMEM.

圖4HE染色檢測心肌細(xì)胞移植2周后低溫心衰大鼠心肌組織的病理變化

Figure 5. Apoptosis of myocardial tissues from heart failure rats in the normal or cold environment (TUNEL, scale bar=20 μm). Group a: normal rats in the normal environment; group b: normal rats in the cold environment; group c: heart failure rats in the normal environment; group d: heart failure rats in the cold environment. Arrows indicate apoptotic cells.

圖5TUNEL法檢測正?；虻蜏貤l件下心衰大鼠心肌組織的凋亡情況

5MicroRNA-21的相對表達(dá)量

5.1心力衰竭動物模型 各樣本反應(yīng)達(dá)到預(yù)設(shè)熒光信號時(shí),常溫條件下正常組microRNA-21和內(nèi)參照U6的循環(huán)數(shù)分別為21.63±0.04和14.27±0.02,低溫條件下正常組分別為23.71±0.05和16.69±0.06,常溫條件下心力衰竭組分別為28.91±0.02和15.73±0.05,低溫條件下心力衰竭組分別為29.88±0.06和16.52±0.03。2-ΔΔCt法分析結(jié)果顯示，與常溫件下正常組相比, 低溫條件下正常組的microRNA-21的表達(dá)量下調(diào), 約0.5倍(P<0.05);常溫條件下心力衰竭組的microRNA-21的表達(dá)量明顯下調(diào), 約1/16倍(P<0.05);低溫條件下心力衰竭組的microRNA-21的表達(dá)量下調(diào)更明顯, 約1/32(P<0.05)，見圖6。

5.2細(xì)胞移植 正常心肌細(xì)胞組microRNA-21和U6循環(huán)數(shù)分別為33.65±0.18和21.43±0.63, 轉(zhuǎn)染了過表達(dá)microRNA-21的重組慢病毒載體的心肌細(xì)胞組分別為30.71±0.47和26.51±0.43。2-ΔΔCt法分析結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)染了過表達(dá)microRNA-21重組慢病毒表達(dá)載體的心肌細(xì)胞中microRNA-21的表達(dá)顯著高于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05), 約3倍，見圖7。

6移植的心肌細(xì)胞的存活情況

I組和II組心肌組織抗BrdU免疫組化染色顯示心肌細(xì)胞胞漿淡染, 宿主心肌細(xì)胞胞核較細(xì)長, 呈深藍(lán)色,移植的乳鼠心肌細(xì)胞胞核多呈卵圓形, 棕褐色,提示移植的心肌細(xì)胞在低溫條件下心力衰竭大鼠的心肌組織中能存活，見圖8。

Figure 6. The expression of microRNA-21 in myocardial tissues from heart failure rats in the normal or cold environment detected by qRT-PCR. Group a: normal rats in the normal environment; group b: normal rats in the cold environment; group c: heart failure rats in the normal environment; group d: heart failure rats in the cold environment. Mean±SD.*P<0.05vsgroup a;#P<0.05vsgroup b;△P<0.05vsgroup c.

圖6qRT-PCR檢測正?；虻蜏貤l件下心衰大鼠心肌組織中microRNA-21的表達(dá)

Figure 7. The expression of microRNA-21 in cardiomyocytes in microRNA-21 transfection group and control group detected by qRT-PCR.Mean±SD.*P<0.05vscontrol group.

圖7qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后心肌細(xì)胞中microRNA-21的表達(dá)

Figure 8. Survival of cardiomyocytes transplanted into myocardial tissues of heart failure rat in the cold environment (immunohistochemical staining for BrdU, scale bar=20 μm). Group I: transplanted with microRNA-21-transfected cardiomyocytes; group II: transplanted with untransfected cardiomyocytes. The cytoplasm of cardiomyocytes was stainless, while the nuclei of transplanted cardiomyocytes were ovate and stained in brown (arrows).

圖8抗BrdU免疫組化染色法檢測低溫心衰大鼠心肌組織中移植的心肌細(xì)胞的存活情況

討 論

心力衰竭(心衰)仍是目前導(dǎo)致死亡和致殘的主要原因,每年死亡率高達(dá)7.2%。當(dāng)今社會隨著生態(tài)環(huán)境的不斷被破壞,極端氣候已經(jīng)成為21世紀(jì)危害人類健康的第一殺手,成為心臟疾病患者誘發(fā)心衰的主要因素之一[12]。然而目前對于低溫條件下心力衰竭的研究尚未在國內(nèi)外完全開展。本研究通過利用阿霉素及氣候箱模擬構(gòu)建低溫條件下心力衰竭模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫對正常大鼠的心功能及心肌細(xì)胞凋亡率無明顯影響,但對心衰大鼠具有明顯影響,能明顯降低心功能及增加心肌細(xì)胞凋亡率,故本研究以低溫條件下心力衰竭大鼠模型作為研究基石,以尋找治療低溫條件下心力衰竭的有效基因及探討相關(guān)機(jī)制。

本研究通過利用qRT-PCR檢測常/低溫條件下正常大鼠及心力衰竭大鼠心肌組織中的microRNA-21的表達(dá),結(jié)果顯示microRNA-21對阿霉素和低溫都敏感。阿霉素能明顯下調(diào)心肌組織中microRNA-21的表達(dá),提示microRNA-21可能參與氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)的心血管疾病如心力衰竭的病理生理過程;在低溫條件下的大鼠模型中,低溫條件能更明顯下調(diào)心肌組織中microRNA-21的表達(dá),提示microRNA-21可能參與低溫條件下的心血管疾病如低溫條件下心力衰竭的病理生理過程?？偠灾?在低溫條件下心力衰竭大鼠心肌組織中microRNA-21明顯下調(diào),與心肌組織凋亡程度及心功能呈負(fù)相關(guān),揭示microRNA-21可能是保護(hù)性因子,故本研究通過心肌細(xì)胞移植及慢病毒轉(zhuǎn)染法上調(diào)低溫條件下心力衰竭大鼠心肌組織中microRNA-21的表達(dá)以達(dá)到治療作用。

隨著基礎(chǔ)和臨床研究的不斷開展,細(xì)胞移植治療心力衰竭已取得了很大的進(jìn)展[13-14]。心肌細(xì)胞移植治療時(shí),所移植的細(xì)胞必須能到達(dá)心臟受損部位并在疤痕組織存活、分化;移植或分化后的細(xì)胞需具有收縮能力,并和疤痕外的自身心肌細(xì)胞形成有效細(xì)胞縫隙連接及電生理偶聯(lián)。目前大量動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)心肌細(xì)胞移植于宿主心肌組織中不僅能存活,并且能與宿主心肌組織建立縫隙連接并改善宿主心功能。然而單純的細(xì)胞移植有一定的局限性,移植細(xì)胞的存活與進(jìn)一步分化成熟很大程度上決定了心功能的改善程度[15]。而衰竭的心肌組織不利于細(xì)胞生存,降低了移植效果。因此近年來有學(xué)者將microRNA與細(xì)胞移植聯(lián)合進(jìn)行注射,發(fā)現(xiàn)能更良好地改善心功能[10]。Sayed等[6]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)microRNA-21的轉(zhuǎn)基因大鼠能抑制PTEN及FasL的表達(dá)上調(diào),縮小梗死面積及減輕心衰的進(jìn)展。本研究將過表達(dá)microRNA-21的心肌細(xì)胞移植于低溫條件下心力衰竭大鼠的心肌組織中,顯著改善了衰竭心肌組織的心功能。本研究選擇出生24 h內(nèi)的乳鼠心肌細(xì)胞為研究對象,抗BrdU免疫組化結(jié)果顯示大部分移植細(xì)胞抗BrdU染色呈陽性,提示移植的乳鼠心肌細(xì)胞在宿主衰竭的心肌組織中大部分能存活,其中部分具有復(fù)制及分裂增生能力。心臟彩超結(jié)果顯示,在單純心肌細(xì)胞移植組,細(xì)胞移植后其左室前壁厚度增厚,左室舒張末期容積減小,與單純DMEM培養(yǎng)基移植組相比有明顯差異,說明抑制心室擴(kuò)大及重構(gòu)的主要因素在于移植細(xì)胞對瘢痕組織的替代作用和細(xì)胞性心肌塑形作用。在lenti-microRNA-21轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞移植組,心功能的改善優(yōu)于單純心肌細(xì)胞移植組,左室舒張末期容積減小及室壁厚度增厚更明顯,進(jìn)一步說明心功能的改善有利于移植細(xì)胞的存活,提高了移植存活細(xì)胞數(shù)量,而存活的移植細(xì)胞防止了瘢痕區(qū)進(jìn)一步擴(kuò)張,從而抑制了宿主心室重構(gòu)。HE染色病理切片也證實(shí)移植單純心肌細(xì)胞及轉(zhuǎn)染了過表達(dá)microRNA-21的重組慢病毒表達(dá)載體的心肌細(xì)胞后能減輕宿主心肌組織病理改變,其中以后者更顯著,這對于移植心肌細(xì)胞的存活是至關(guān)重要的。總而言之, 新生乳鼠心肌細(xì)胞移植能夠在宿主大鼠心肌組織中存活并改善其心功能;轉(zhuǎn)染了microRNA-21的心肌細(xì)胞更能夠明顯改善宿主心功能,從而揭示microRNA-21可能在未來治療低溫條件下的心力衰竭中發(fā)揮重要的作用。

在移植實(shí)驗(yàn)中,移植單純培養(yǎng)基組移植后有3只大鼠死亡,可能與低溫條件下心力衰竭大鼠心功能差導(dǎo)致大鼠不能承受開胸有關(guān)。在移植后,移植心肌細(xì)胞(包括轉(zhuǎn)染組)的2組共計(jì)3只大鼠死亡,可能與持續(xù)應(yīng)用免疫抑制劑有關(guān)。因此,如何選擇合適的免疫抑制劑治療劑量和療程還有待進(jìn)一步研究。

[1] Feldman DE, Platt R, Déry V, et al. Seasonal congestive heart failure mortality and hospitalization trends, Quebec 1990-1998 [J].J Epidemiol Community Health, 2004, 58(2): 129-130.

[2] Sun Z. Cardiovascular responses to cold exposure [J]. Front Biosci (Elite Ed), 2010, 2: 495-503.

[3] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function [J].Cell, 2004, 116(2):281-297.

[4] Pushparaj PN, Aarthi JJ, Kumar SD, et al. RNAi and RNAa: the Yin and Yang of RNAome [J].Bioinformation,2008,2(6):235-237.

[5] Roy S, Khanna S, Hussain SR, et al. MicroRNA expression in response to murine myocardial infarction: miR-21 regulates fibroblast metalloprotease-2 via phosphatase and tensin homologue [J]. Cardiovas Res, 2009, 82(1):21-29.

[6] Sayed D, He M, Hong C, et al. MicroRNA-21 is a downstream effector of AKT that mediates its anti-apoptotic effects via suppression of Fas ligand [J]. J Biol Chem, 2010, 285(26): 20281-20290.

[7] Biggar KK, Dubuc A, Storey K. MicroRNA regulation below zero:differential expression of miRNA-21 and miRNA-16 during freezing in wood frogs[J]. Cryobiology, 2009, 59(3): 317-321.

[8] Yin C, Wang X, Kukreja RC. Endogenous microRNAs induced by heat-shock reduce myocardial infarction following ischemia-reperfusion in mice [J]. FEBS Lett, 2008, 582(30): 4137-4142.

[9] Gammell P, Barron N, Kumar N, et al. Initial identification of low temperature and culture stage induction of miRNA expression in suspension CHO-K1 cells[J]. J Biotechnol, 2007, 130(3): 213-218.

[10]de Muinck ED. Gene and cell therapy for heart failure [J]. Antioxid Redox Signal, 2009, 11(8): 2025-2042.

[11]Li S, Liang Z, Xu L, et al. MicroRNA-21: a ubiquitously expressed pro-survival factor in cancer and other diseases [J]. Mol Cell Biochem, 2012, 360(1-2):147-158.

[12]Cohn JN, Bristow MR, Chien KR, et al. Report of the National Heart, Lung and Blood Institute. Special Emphasis Panel on Heart Failure Research [J].Circulation, 1997, 95(4):766-770.

[13]張 勇，蔡振杰，陳如坤．自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療兔缺血心肌的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中國病理生理雜志，2005，21(2)：356-360．

[14]蒙艷斌，賀莉萍，錢海燕．胚胎干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死后心肌病理形態(tài)學(xué)及血流動力學(xué)變化[J]．中國病理生理雜志，2005，21(3)：601-603．

[15]郎明建，曾秋棠，關(guān)思虞，等. 血管內(nèi)皮生長因子基因轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞移植對心肌梗死大鼠心功能的影響[J].中國病理生理雜志，2006,22(9)：1684-1688.

EffectofmicroRNA-21-transfectedcardiomyocytetransplantationonheartfailureratsunderlow-temperaturecondition

TANG Yan1,2, WANG Meng-hong1

(1DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China;2DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofNanhuaUniversity,Hengyang421001,China.E-mail:wmh666888@sina.com)

AIM: To investigate the effects of microRNA-21 on heart failure rats under the low-temperature condition.METHODSThe rat model of heart failure was constructed by injection of adriamycin and the rats were placed in a climate box. The cardiac functions, the apoptotic index and pathological changes of the myocardium were determined. The expression of microRNA-21 in the myocardium of the rats was detected by qRT-PCR. Neonatal cardiomyocytes were culturedinvitro, labeled with BrdU and transferred with lenti-microRNA-21 by DNA transfection. The heart failure rats in the cold environment were randomly divided into 3 groups: the rats in group I were transplanted with lenti-microRNA-21-transfected neonatal cardiomyocytes, the rats in group II were transplanted with untransfected cardiomyocytes and the rats in group III were transplanted with culture medium into the failure myocardium. The echocardiography was applied to evaluate the heart functions. The rats were then executed and the hearts were harvested for histological (HE staining) and immunohistological (anti-BrdU staining) examinations.RESULTSThe cardiac functions of the heart failure rats in the cold environment (group d) were significantly worse than those in the normal environment (group c). The cardiac functions in group c were significantly worse than those in the normal rats in the normal environment (group a). No obvious difference of the cardiac functions between group a and group b (the normal rats in the cold environment) was observed. The apoptotic index of the myocardium in group d was significantly higher than that in group c, and that in group c was significantly higher than that in group a. No obvious difference of the apoptotic index of myocardium between group a and group b was found. The expression level of microRNA-21 in the myocardium in group c was significantly lower than that in group a, that in group d was lower than that in group c, and that in group b was also lower than that in group A. The expression of microRNA-21 in the transfected groups was higher than that in untransfected groups. Improvement of ejection fraction (EF) in group I and group II was greater than that in group III. The transplanted cardiomyocytes survived in the failure myocardium. The pathological changes of the myocardium in group I and group II were improved as compared with those in group III. The cardiac functions and pathological improvement in the myocardium were better in group I than those in group II.CONCLUSIONTransplantation of microRNA-21-transfected cardiomyocytes into the myocardium of heart failure rats under the low-temperature condition improves the cardiac functions and relieves the pathological changes.

Heart failure; Cardiomyocytes; MicroRNA-21; Transplantation

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2013.01.001

1000-4718(2013)01-0001-08

2012-03-27

2012-10-29

國家科技支撐計(jì)劃(No.2008BAI68BA02)

△通訊作者 Tel: 0791-88692501; E-mail:wmh666888@sina.com