熱帶假絲酵母SG-1產單細胞蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

江西農業(yè)大學生物科學與工程學院 李昆太 周 佳 龐會忠 葉亞健 程 新

單細胞蛋白（SCP）又稱微生物蛋白或菌體蛋白，通?？赏ㄟ^細菌、酵母菌等微生物利用食品工業(yè)及輕工業(yè)的副產品或下腳料發(fā)酵培養(yǎng)而得 （郭狀等，2008；許倩等，2007）。酵母菌是廣泛用于生產SCP的菌種，主要包括假絲酵母屬、絲孢酵母屬、漢森酵母屬和接合豆孢酵母屬等（馬旭光和張宗舟，2010）。SCP所含的營養(yǎng)物質極為豐富，具有豐富的粗蛋白質、氨基酸、維生素和促生長因子，是一類理想的蛋白質飼料（張建剛，2010）。因此，利用非食用資源和廢棄資源開發(fā)和推廣微生物生產單細胞蛋白飼料已成為補充飼料蛋白來源不足的重要途徑（張秋華等，2009）。甜高粱秸稈汁是一類糖含量豐富的農副產品，本文以甜高粱秸稈汁為主要發(fā)酵原料，采用DPS軟件（DPS v 7.05版）的二次正交旋轉中心組合試驗設計方法對熱帶假絲酵母SG-1產SCP的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以期為SCP的工業(yè)化發(fā)酵生產奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 甜高粱秸稈汁、工業(yè)葡萄糖、工業(yè)蛋白胨，其他無機鹽試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器 搖床、低速大容量離心機、烘箱、培養(yǎng)箱等。

1.3 菌種 熱帶假絲酵母SG-1（Candida tropicalis SG-1）：由本實驗室保存。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 斜面培養(yǎng)基 工業(yè)葡萄糖 20 g/L，工業(yè)蛋白胨 10 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41 g/L，NaC10.1 g/L，瓊脂 20 g/L；pH 自然。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)基組分 甜高粱秸稈汁、工業(yè)葡萄糖、 工業(yè)蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4；pH 自然。

1.5 方法

1.5.1 斜面培養(yǎng) 從-20℃的冰箱中取出保藏好的甘油管菌種，接種于配制好的斜面，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 h。

1.5.2 搖瓶分批發(fā)酵 以無菌水洗下斜面上的菌體，制成菌懸液。取菌懸液1 mL接至裝量為30 mL/250 mL三角瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃振蕩（180 r/min）培養(yǎng)36 h。測定結果為三個平行樣的平均值。

1.6 單細胞蛋白的測定方法 吸取30 mL發(fā)酵液，4000 r/min下離心10 min，離心所得菌體以蒸餾水清洗三次后在65℃下烘干至恒重。采用凱氏定氮法測定干菌體中粗蛋白質含量。根據公式：單細胞蛋白含量（g/L）=菌體干重（g/L）×粗蛋白質含量，計算出發(fā)酵液中的單細胞蛋白產量 （高玉榮等，2010）。

2 結果與討論

以放瓶時（36 h）的SCP產量為考察指標，應用DPS軟件（DPS v 7.05版）的二次正交旋轉中心組合試驗設計方法對熱帶假絲酵母SG-1的發(fā)酵培養(yǎng)基（甜高粱秸稈汁、工業(yè)葡萄糖、工業(yè)蛋白胨、MgSO4·7H2O 和 KH2PO4）進行優(yōu)化。 試驗因素和水平設計見表1，試驗設計和結果見表2。

表1 二次正交旋轉組合設計因素水平表及編碼值

由表2可見，在所有試驗配方中，1號配方（即：甜高粱秸稈汁180 mL/L；工業(yè)葡萄糖 30 g/L，工業(yè)蛋白胨 30 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，KH2PO43 g/L）的SCP產量最高，達13.84 g/L。為了進一步探討發(fā)酵培養(yǎng)基各組分之間的交互作用以及合適的組分控制濃度，對試驗結果進行方差分析，結果見表3。

由表3可見，當顯著水平為0.01時，X1、X2、X3這三項達均到極顯著水平，即發(fā)酵培養(yǎng)基中甜高粱秸稈汁、葡萄糖及蛋白胨的用量對熱帶假絲酵母SG-1產SCP影響均極顯著。對試驗數(shù)據進行二次多項回歸擬合，獲得多元二次回歸方程：

表2 熱帶假絲酵母SG-1二次正交旋轉組合設計及試驗結果

式中，Y 為 SCP 的預測值；X1、X2、X3和 X4分別為甜高粱秸稈汁、工業(yè)葡萄糖、工業(yè)蛋白胨、MgSO4·7H2O 和 KH2PO4的編碼值。

由于該模型比較復雜，響應曲面函數(shù)既沒有最大值，也沒有最小值。為了更加直觀地說明甜高粱秸稈汁、工業(yè)葡萄糖、工業(yè)蛋白胨、MgSO4·7H2O和KH2PO4對熱帶假絲酵母產SCP的影響以及表征響應曲面函數(shù)的性狀，用DPS軟件作出以兩兩自變量互作效應的三維曲面圖 （圖 1）。

圖1a顯示了甜高粱秸稈汁與葡萄糖的交互作用，發(fā)酵培養(yǎng)基中甜高粱秸稈汁與葡萄糖的濃度對熱帶假絲酵母SG-1產SCP的產量影響極顯著，二者對SCP產量均表現(xiàn)出正效應；圖1b顯示了甜高粱秸稈汁與蛋白胨的交互作用，二者同樣對SCP產量影響極顯著且均表現(xiàn)出正效應；圖1c顯示了甜高粱秸稈汁與無機鹽的交互作用，甜高粱秸稈汁對SCP產量的正作用最為顯著，而無機鹽濃度對SCP產量沒有表現(xiàn)出較大影響；圖1d顯示了葡萄糖與蛋白胨的交互作用，二者在試驗值范圍內均對SCP產量表現(xiàn)出顯著的正效應；圖1e顯示了葡萄糖與無機鹽的交互作用，在試驗值范圍內，它們的交互效應不顯著，但葡萄糖對SCP產量表現(xiàn)出一定的正效應；圖1f顯示了蛋白胨與無機鹽的交互作用，在試驗值范圍內，它們的交互效應也不顯著，而蛋白胨對SCP產量表現(xiàn)出一定的正效應。

表3 試驗數(shù)據方差分析結果

以上結果可以說明，發(fā)酵培養(yǎng)基中的甜高粱秸稈汁、葡萄糖與蛋白胨用量對熱帶假絲酵母SG-1產SCP的影響均極顯著，在試驗值范圍內隨著其濃度的提高，SCP產量均表現(xiàn)出極顯著的上升趨勢。因此，用DPS軟件優(yōu)化的熱帶假絲酵母SG-1發(fā)酵培養(yǎng)基為所考察的4個因素均應取最高水平值（+1.6818），即甜高粱秸稈汁 220 mL/L、葡萄糖 37.5 g/L、 蛋白胨 37.5 g/L、MgSO4·7H2O 3.75 g/L、KH2PO43.75 g/L。以該優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行熱帶假絲酵母SG-1搖瓶分批發(fā)酵的驗證試驗，最終的菌體濕重達到129.04 g/L，干重為34.20 g/L，SCP產量為15.38 g/L，比原始配方下SCP產量（10.77 g/L）提高了42.80%。

3 結論

在以二次正交旋轉組合設計方法 （DPS軟件v7.05版）進行熱帶假絲酵母SG-1產SCP的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中甜高粱秸稈汁、葡萄糖與蛋白胨的用量對熱帶假絲酵母SG-1產SCP表現(xiàn)出極顯著的正效應。因此，熱帶假絲酵母SG-1產SCP的較佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：甜高粱秸稈汁220 mL/L、葡萄糖37.5 g/L、蛋白胨37.5 g/L、MgSO4·7H2O 3.75 g/L、KH2PO43.75g/L。該發(fā)酵培養(yǎng)基配方下SCP產量達到15.38 g/L，比初始發(fā)酵培養(yǎng)基配方下的SCP產量（10.77 g/L）提高了42.80%。

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