劉 瑞, 郝春媛, 鄧秀玲, 楊予白
(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理和病理生理學(xué)系,陜西 西安 710061; 2西安市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科,陜西 西安 710002)
神經(jīng)細(xì)胞黏附分子通過非Wnt依賴的β-catenin途徑促進(jìn)小鼠黑色素瘤細(xì)胞增殖
劉 瑞1△, 郝春媛2, 鄧秀玲1, 楊予白1
(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理和病理生理學(xué)系,陜西 西安 710061;2西安市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科,陜西 西安 710002)
目的研究神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)對小鼠黑色素瘤B16-F0細(xì)胞增殖的影響及其分子機(jī)制。方法采用RNA干擾在B16-F0細(xì)胞中基因沉默NCAM,通過MTT和軟瓊脂克隆形成實驗考察細(xì)胞增殖能力的變化;通過小鼠皮下腫瘤移植實驗考察體內(nèi)黑色素瘤生長的變化;使用免疫印跡篩選出受NCAM影響的信號分子,在此基礎(chǔ)上使用RNA干擾和高表達(dá)實驗確定介導(dǎo)NCAM調(diào)控增殖的主要信號分子。結(jié)果NCAM基因沉默后B16-F0細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力明顯降低,細(xì)胞在小鼠皮下形成的黑色素瘤的生長也明顯受到抑制。其中,β-catenin介導(dǎo)了NCAM對于B16-F0細(xì)胞增殖的調(diào)控,但NCAM對于β-catenin的調(diào)控不依賴于經(jīng)典的Wnt通路。結(jié)論NCAM通過Wnt非依賴性的β-catenin通路促進(jìn)小鼠黑色素瘤細(xì)胞的增殖。
神經(jīng)細(xì)胞黏附分子; 黑色素瘤; β-catenin; 細(xì)胞增殖
黑色素瘤是由神經(jīng)脊來源的黑色素細(xì)胞異常增生引發(fā)的皮膚腫瘤,惡性程度極高,在皮膚腫瘤導(dǎo)致死亡的病例中,黑色素瘤占有約80%的比例,而且晚期黑色素瘤的預(yù)后很差,平均5年生存期不到5%[1]。黑色素瘤在我國發(fā)病近年來成倍增長,2000年發(fā)病率統(tǒng)計僅為 0.2/10萬,2005-2007年我國發(fā)病率約1/10萬,每年新發(fā)病例約2萬人[2],因此,黑色素瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重危及我國人民健康的疾病之一。晚期惡性黑色素瘤的臨床治療效果在近幾十年來并沒有明顯的改善,作為惡性黑色素瘤化療藥物的金標(biāo)準(zhǔn)達(dá)卡巴嗪,其腫瘤治療反應(yīng)率也僅僅在5%左右[3],因此對于黑色素瘤增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究,仍然是非常重要而迫切的任務(wù),而對于調(diào)控黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展的分子信號機(jī)制的評估對于找到新的治療靶點具有非常重要的基礎(chǔ)和臨床意義。神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)為黏附分子中免疫球蛋白超家族的一員,按照分子量大小,共有NCAM120、NCAM140和NCAM180三種亞型。NCAM主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng),在神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化、遷移以及軸突的生長中起著非常重要的作用,但近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn),NCAM和多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[4]。黏附分子和黑色素瘤的關(guān)系近年來引起了更多的關(guān)注,多種黏附分子可以通過介導(dǎo)細(xì)胞間黏附狀態(tài)的變化以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展[5-7],但是,關(guān)于NCAM和黑色素瘤的關(guān)系,目前除了少數(shù)臨床描述性研究結(jié)果以外[8-9],并無其它相關(guān)報道。為此,本研究擬采用小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16-F0為對象,考察NCAM與黑色素瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)性以及其中介導(dǎo)的分子機(jī)制。
1材料
SPF級雌性C57BL/6J小鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供,動物的飼養(yǎng)和處死均遵循西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會制定的基本動物實驗倫理原則進(jìn)行。小鼠B16-F0黑色素瘤細(xì)胞購置于ATCC細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)材料包括:細(xì)胞培養(yǎng)基高糖DMEM購自Gibco;胎牛血清(fetal calf serum, FCS)購自Invitrogen;NaHCO3購自Sigma;HEPES購自Sigma青、鏈霉素購自Invitrogen。RNA干擾質(zhì)粒pSilencer 4.1-CMV購自Ambion。高表達(dá)β-catenin的質(zhì)粒pβ-catenin為新加坡南洋理工大學(xué)生命科學(xué)院馮志偉教授饋贈。β-catenin的單鏈RNA干擾試劑β-catenin-siRNA (sc-29210)以及相應(yīng)對照siRNA (sc-37007)購自Santa Cruz。Lipofectamine 2000和G418購自 Invitrogen。細(xì)胞增殖MTT試劑盒購自Roche Applied Science。實驗中使用到的Ⅰ抗包括:NCAM(AB5032)購自Millipore;β-catenin (#9562)和p-LRP5/6 (Ser-1490;#2568)購自Cell Signaling Technology;LRP5/6 (sc-57354)購自Santa Cruz;β-actin(A5441)和GAPDH(G8795)購自Sigma。SYBR定量PCR試劑盒購自KAPA Biosystems。
2方法
2.1細(xì)胞培養(yǎng) B16-F0細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM中,其中含有10% FCS、20 mmol/L NaHCO3、5 mmol/L HEPES以及 1% 青、鏈霉素,80%融合時傳代。
2.2質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 選取針對NCAM的特異性靶序列5’-CGA CTT CTT TGG CCA CTA TAC-3’,把針對靶序列的能產(chǎn)生穩(wěn)定小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA, shRNA)的DNA序列克隆入RNA干擾質(zhì)粒pSilencer 4.1-CMV中,以打亂后的隨機(jī)序列構(gòu)建的Scrambled shRNA為對照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000的說明書進(jìn)行操作。穩(wěn)定表達(dá)NCAM shRNA(shNCAM)和scrambled shRNA(sh-CTRL)的細(xì)胞系用800 mg/L G418篩選。轉(zhuǎn)染后6 h更換新鮮培養(yǎng)液,然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞用于下一步實驗。
2.3細(xì)胞增殖實驗 B16-F0細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中,接種密度為2 000 cells/well,培養(yǎng)時間96 h。細(xì)胞的相對增殖率使用具體方法為,收集各時點的細(xì)胞用含有MTT的新鮮培養(yǎng)液孵育4 h,然后在相應(yīng)溶解液中孵育過夜后,在Tecan GENios測量儀上于570 nm下測量吸光度。實驗均重復(fù)3次,取均值。
2.4軟瓊脂克隆實驗 在60 mm培養(yǎng)皿中,2×104個腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含0.3% 瓊脂和10% FCS的高糖DMEM培養(yǎng)液中,其中培養(yǎng)皿預(yù)先用含0.35%瓊脂的DMEM培養(yǎng)液包被。細(xì)胞克隆在14 d后用0.5%的結(jié)晶紫染色計數(shù)。實驗重復(fù)3次取均值。
2.5皮下黑色素瘤動物模型 12只雌性C57BL/6J小鼠(6~8周,15~20 g)隨機(jī)分為2組,每組6只,分別在背部皮下注射7.5×105個穩(wěn)定表達(dá)shNCAM或shCTRL的B16-F0黑色素瘤細(xì)胞,間隔2 d觀察皮下腫瘤的生長情況,3周后脫頸處死動物,分離皮下的腫瘤并測量腫瘤大小和重量。
2.6免疫印跡 細(xì)胞在裂解液(50 mmol/L Tris,100 mmol/L NaCl,5 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA,5 mmol/L MgCl2,1% Triton X-100,1%甘油以及1×的蛋白酶抑制劑)中置于冰上裂解1 h,15 000×g、4 ℃離心15 min,收集上清蛋白液。蛋白液測量濃度后,取20~40 μg蛋白使用SDS-PAGE分離,然后把蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。其后使用5%的脫脂牛奶封閉1 h后,與含有第Ⅰ抗體的5%脫脂牛奶在4 ℃孵育過夜,PBST清洗后,再與HRP偶聯(lián)的第Ⅱ抗體孵育1 h。此后加入反應(yīng)發(fā)光液進(jìn)行信號采集(Immobilon Western Chemiluminescent HRP底物系統(tǒng),購自Millipore)。實驗均重復(fù)3次。
2.7實時熒光定量PCR 遵照KAPA SYBR定量PCR說明書進(jìn)行,95 ℃預(yù)變性20 s,然后運行40個PCR循環(huán),每個循環(huán)95 ℃ 3 s,60 ℃ 1 min。使用的引物序列為:Wnt3A 正義鏈5’-CTC CTC TCG GAT ACC TCT TAG TG-3’,反義鏈5’-GCA TGA TCT CCA CGT AGT TCC TG-3’;LRP5正義鏈5’-AAG GGT GCT GTG TAC TGG AC-3’,反義鏈5’-AGA AGA GAA CCT TAC GGG ACG-3;LRP6正義鏈5’-TTG TTG CTT TAT GCA AAC AGA CG-3’,反義鏈5’-GTT CGT TTA ATG GCT TCT TCG C-3’;Frizzled7 正義鏈5’-CGG GGC CTC AAG GAG AGA A-3’,反義鏈5’-GTC CCC TAA ACC GAG CCA G-3’;Frizzled8(正義鏈5’-ATG GAG TGG GGT TAC CTG TTG-3’,反義鏈5’-CAC CGT GAT CTC TTG GCA C-3’。
3統(tǒng)計學(xué)處理
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間比較使用SPSS 17.0采用t檢驗以及方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
1NCAM基因沉默顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞B16-F0的增殖
使用針對NCAM的能夠產(chǎn)生shRNA的干擾質(zhì)粒pSilencer 4.1-CMV-CAM轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,篩選出穩(wěn)定表達(dá)shRNA的細(xì)胞系shNCAM,Western blotting顯示該細(xì)胞NCAM的表達(dá)水平明顯受到抑制,見圖1A。MTT細(xì)胞增殖實驗表明,在NCAM沉默后,細(xì)胞的生長速度明顯下降(P<0.05),見圖1B。同時,軟瓊脂克隆實驗顯示在NCAM沉默后,腫瘤細(xì)胞形成克隆的大小和數(shù)目均受到顯著性抑制(P<0.05),見圖1C、D。為了排除NCAM沉默后細(xì)胞總數(shù)目的降低可能由于凋亡增加引起,我們同時對比了兩種細(xì)胞的凋亡比例,發(fā)現(xiàn)NCAM沉默對B16-F0細(xì)胞的凋亡并沒有顯著影響。這些結(jié)果提示,NCAM具有促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞B16-F0增殖的作用。
Figure 1.NCAMsilencing inhibited the proliferation of B16-F0 cells. A: NCAM protein expression determined by Western blotting; B: cell proliferation detected by MTT assay; C: colony formation observed under microscope (crystal violet staining, scale bar=100 μm). Mean±SD.n=6 in B;n=9 in C.*P<0.05vsshCTRL.
圖1NCAM基因沉默抑制B16-F0細(xì)胞的增殖
2NCAM基因沉默顯著抑制B16-F0黑色素瘤在小鼠皮下的生長
分別在C57BL/6J小鼠皮下接種shCTRL野生型和shNCAM細(xì)胞,3周以后的結(jié)果表明,相比對照組,NCAM沉默的B16-F0細(xì)胞在皮下的生長受到顯著抑制,見圖2A,解剖分離出的腫瘤的大小和重量均存在顯著差異,shNCAM細(xì)胞形成的腫瘤大小和重量均顯著小于對照組(P<0.05),見圖2B、C。以上的離體細(xì)胞培養(yǎng)和在體動物實驗均表明,NCAM對于黑色素瘤細(xì)胞B16-F0的增殖具有顯著促進(jìn)作用,而下調(diào)NCAM的表達(dá)水平即可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長。
Figure 2.NCAMsilencing inhibited the growth of melanoma in mice. B16-F0 cells were subcutaneously transplanted into the back of C57BL/6J mice. A: representative mice 3 weeks after transplantation, with arrows indicating the subcutaneous melanoma; B: the size of the tumors; C: the weight of the tumors. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsshCTRL.
圖2NCAM基因沉默抑制小鼠黑色素瘤的生長
3NCAM通過β-catenin調(diào)控B16-F0細(xì)胞的增殖
NCAM沉默后,β-catenin水平明顯降低,見圖3A。β-catenin的下調(diào)能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖水平,見圖3B;高表達(dá)β-catenin能夠顯著恢復(fù)shNCAM細(xì)胞的增殖性能,見圖3C。以上實驗結(jié)果說明,NCAM主要通過影響β-catenin而調(diào)控B16-F0細(xì)胞的增殖。
Figure 3. NCAM regulated the proliferation of B16-F0 cells via β-catenin. A: the expression of total β-catenin and cytosolic β-catenin in B16-F0 cells transfected withNCAMshRNA was detected by Western blotting; B: the proliferation of B16-F0 cells transiently transfected with β-catenin siRNA; C: the proliferation of B16-F0 cells withNCAMsilencing and/or β-catenin overexpression. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsother groups.
圖3NCAM通過β-catenin調(diào)控B16-F0細(xì)胞的增殖
4NCAM對β-catenin的調(diào)控不依賴于經(jīng)典的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
NCAM表達(dá)降低以后,磷酸化LRP5/6并無明顯改變,見圖4A。實時熒光定量 PCR結(jié)果表明受體Frizzled以及Wnt3A的表達(dá)水平均無顯著變化,見圖4B。上述結(jié)果說明,NCAM對于β-catenin的影響并非通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin途徑,可能存在NCAM調(diào)控β-catenin的新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
Figure 4.NCAMsilencing down-regulated β-catenin expression in B16-F0 cells via a novel pathway independent of canonical Wnt pathway. A: the phosphorylation of LRP5/6 was detected by Western blotting; B: the mRNA levels of Wnt3A and its receptors Frizzled7, Frizzled8, LRP5 and LRP6 were determined by real-time PCR. Mean±SD.n=4.
圖4NCAM基因沉默并非通過經(jīng)典的Wnt信號通路下調(diào)β-catenin表達(dá)
NCAM是神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)的黏附分子,在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的黏附、增殖、分化、遷移和軸突的生長中起著重要作用。近年的研究發(fā)現(xiàn),NCAM在多種腫瘤的發(fā)展中也起著重要作用,但NCAM和黑色素瘤的關(guān)系目前報道很少。本研究結(jié)果表明,NCAM能夠顯著促進(jìn)小鼠黑色素瘤B16-F0細(xì)胞細(xì)胞的增殖,其中β-catenin為NCAM調(diào)控B16-F0增殖的主要信號分子,而NCAM對于β-catenin的調(diào)控獨立于經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。我們的研究成果闡明了NCAM激發(fā)的信號通路在黑色素瘤的進(jìn)展中所扮演的角色,為黑色素瘤治療方法的發(fā)展提供了更多的基礎(chǔ)研究證據(jù)。
黑色素細(xì)胞在向黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程中,非常顯著的行為學(xué)改變即是細(xì)胞增殖異常[10],而且細(xì)胞的增殖能力也決定著黑色素瘤的進(jìn)展和預(yù)后。關(guān)于黑色素瘤增殖調(diào)控機(jī)制的研究對于發(fā)展黑色素瘤新的治療方法具有重要的意義。以往的研究已經(jīng)揭示出NCAM參與了多種腫瘤的進(jìn)展。我們的前期研究曾發(fā)現(xiàn)NCAM能夠促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[11],在本研究中,我們進(jìn)一步揭示出NCAM能夠促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖,在黑色素瘤細(xì)胞B16-F0中沉默NCAM能夠顯著抑制黑色素瘤的生長,包括其增殖能力、克隆形成能力以及腫瘤的生長速度均得到抑制。近期的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),除了NCAM,其它免疫球蛋白超家族類的黏附分子,比如黏附分子CD171[12]和CD146[6]均能夠促進(jìn)黑色素瘤的進(jìn)展。上述的結(jié)果揭示,黏附分子也許可以作為黑色素瘤進(jìn)展的一個標(biāo)志物。
NCAM不僅僅介導(dǎo)黏附,同時還可以激活多種信號通路,包括與黑色素瘤進(jìn)展密切關(guān)聯(lián)的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinosiol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)通路[13]。但是,在我們的研究中,并沒有發(fā)現(xiàn)這兩條經(jīng)典信號通路參與了NCAM促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們的實驗表明,β-catenin為NCAM調(diào)控B16-F0細(xì)胞增殖的中心分子。以往的研究曾經(jīng)報道過β-catenin信號通路可以促進(jìn)或者抑制黑色素瘤的進(jìn)展,比如Chien等[14]發(fā)現(xiàn)Wnt3分子能夠通過提高β-catenin水平而抑制B16-F0細(xì)胞的增殖,這個結(jié)論似乎和我們的研究結(jié)果存在矛盾。不過在他們的實驗中,使用RNA干擾降低β-catenin的水平卻不能夠改善Wnt3分子對于黑色素瘤細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng),顯然Wnt分子和β-catenin對于黑色素瘤增殖的影響并不一致。而在本研究中,我們是同時進(jìn)行β-catenin的上調(diào)和下調(diào)來觀察其對于黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響,能夠更有力地說明NCAM是通過β-catenin促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖。
β-catenin是經(jīng)典Wnt通路的中心分子,在缺乏Wnt分子的刺激下,β-catenin在蛋白復(fù)合體中被糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)持續(xù)磷酸化而不具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[15]。當(dāng)Wnt分子結(jié)合到受體Frizzled和LRP5/6后,抑制β-catenin的GSK-3β即脫離蛋白復(fù)合體,釋放出的游離β-catenin即可以進(jìn)入細(xì)胞核而激活相應(yīng)的基因表達(dá)。在經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路中,β-catenin的上調(diào)總是伴隨著Wnt分子和其受體的表達(dá)增加以及受體LRP5/6的磷酸化。但是,在NCAM激活β-catenin的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中,我們的實驗結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)同時并存的表達(dá)上調(diào)的Wnt分子和其受體Frizzled,也沒有發(fā)現(xiàn)LRP5/6磷酸化水平的升高。顯然,NCAM對于β-catenin的調(diào)控不依賴于經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路,在NCAM到β-catenin的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)上,應(yīng)該存在著一條新的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,使NCAM可以通過調(diào)控β-catenin的水平控制黑色素瘤細(xì)胞的增殖。
總之,我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了NCAM通過調(diào)控β-catenin而促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖,而NCAM對于β-catenin信號的影響?yīng)毩⒂诮?jīng)典的Wnt通路。我們的研究揭示了NCAM在黑色素瘤增殖中所起的作用,同時豐富了β-catenin為基礎(chǔ)的信號通路系統(tǒng)。鑒于NCAM的抗體已經(jīng)用于NCAM高表達(dá)腫瘤的臨床試驗中[16-17],而且拮抗NCAM的多肽也正處在積極的開發(fā)階段[18],我們的成果為研究黑色素瘤新的治療方法提供了一個值得參考的靶點。
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NeuralcelladhesionmoleculepromotesproliferationofmousemelanomaB16-F0cellsviaβ-cateninindependentofcanonicalWntpathway
LIU Rui1, HAO Chun-yuan2, DENG Xiu-ling1, YANG Yu-bai1
(1DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,MedicalSchool,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofCardiology,Xi’anNo. 1Hospital,Xi’an710002,China.E-mail:dr.liurui@gmail.com)
AIM: To investigate the effects of neural cell adhesion molecule (NCAM) on the proliferation of mouse melanoma B16-F0 cells, and to further explore the involved signaling pathways.METHODSRNA interference was used to silence the expression ofNCAMin B16-F0 cells, followd by MTT and soft agar assays to evaluate the proliferation. Subcutaneous transplatation ofNCAM-silencing B16-F0 cells into C57BL/6J mice was performed, and the tumor growthinvivowas observed. Western blotting was used to clarify the involved signaling pathways.RESULTSThe proliferation and colony formation of B16-F0 cellsinvitroand the growth of transplanted melanomainvivowere significantly inhibited byNCAMsiRNA. Interestingly, the change of NCAM expression level markedly regulated the activity of β-catenin, and this signaling pathway was independent of canonical Wnt pathway.CONCLUSIONOur findings reveal a novel regulatory role of NCAM in the progression of melanoma, which might serve as a new therapeutic target for the treatment of melanoma.
Neural cell adhesion molecules; Melanoma; β-catenin; Cell proliferation
R739.5
A
1000- 4718(2013)09- 1645- 06
2013- 05- 14
2013- 07- 09
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10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.019