• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    神經(jīng)細(xì)胞黏附分子通過非Wnt依賴的β-catenin途徑促進(jìn)小鼠黑色素瘤細(xì)胞增殖

    2013-10-24 01:44:34郝春媛鄧秀玲楊予白
    中國病理生理雜志 2013年9期
    關(guān)鍵詞:信號轉(zhuǎn)導(dǎo)黑色素瘤調(diào)控

    劉 瑞, 郝春媛, 鄧秀玲, 楊予白

    (1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理和病理生理學(xué)系,陜西 西安 710061; 2西安市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科,陜西 西安 710002)

    神經(jīng)細(xì)胞黏附分子通過非Wnt依賴的β-catenin途徑促進(jìn)小鼠黑色素瘤細(xì)胞增殖

    劉 瑞1△, 郝春媛2, 鄧秀玲1, 楊予白1

    (1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理和病理生理學(xué)系,陜西 西安 710061;2西安市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科,陜西 西安 710002)

    目的研究神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)對小鼠黑色素瘤B16-F0細(xì)胞增殖的影響及其分子機(jī)制。方法采用RNA干擾在B16-F0細(xì)胞中基因沉默NCAM,通過MTT和軟瓊脂克隆形成實驗考察細(xì)胞增殖能力的變化;通過小鼠皮下腫瘤移植實驗考察體內(nèi)黑色素瘤生長的變化;使用免疫印跡篩選出受NCAM影響的信號分子,在此基礎(chǔ)上使用RNA干擾和高表達(dá)實驗確定介導(dǎo)NCAM調(diào)控增殖的主要信號分子。結(jié)果NCAM基因沉默后B16-F0細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力明顯降低,細(xì)胞在小鼠皮下形成的黑色素瘤的生長也明顯受到抑制。其中,β-catenin介導(dǎo)了NCAM對于B16-F0細(xì)胞增殖的調(diào)控,但NCAM對于β-catenin的調(diào)控不依賴于經(jīng)典的Wnt通路。結(jié)論NCAM通過Wnt非依賴性的β-catenin通路促進(jìn)小鼠黑色素瘤細(xì)胞的增殖。

    神經(jīng)細(xì)胞黏附分子; 黑色素瘤; β-catenin; 細(xì)胞增殖

    黑色素瘤是由神經(jīng)脊來源的黑色素細(xì)胞異常增生引發(fā)的皮膚腫瘤,惡性程度極高,在皮膚腫瘤導(dǎo)致死亡的病例中,黑色素瘤占有約80%的比例,而且晚期黑色素瘤的預(yù)后很差,平均5年生存期不到5%[1]。黑色素瘤在我國發(fā)病近年來成倍增長,2000年發(fā)病率統(tǒng)計僅為 0.2/10萬,2005-2007年我國發(fā)病率約1/10萬,每年新發(fā)病例約2萬人[2],因此,黑色素瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重危及我國人民健康的疾病之一。晚期惡性黑色素瘤的臨床治療效果在近幾十年來并沒有明顯的改善,作為惡性黑色素瘤化療藥物的金標(biāo)準(zhǔn)達(dá)卡巴嗪,其腫瘤治療反應(yīng)率也僅僅在5%左右[3],因此對于黑色素瘤增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究,仍然是非常重要而迫切的任務(wù),而對于調(diào)控黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展的分子信號機(jī)制的評估對于找到新的治療靶點具有非常重要的基礎(chǔ)和臨床意義。神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)為黏附分子中免疫球蛋白超家族的一員,按照分子量大小,共有NCAM120、NCAM140和NCAM180三種亞型。NCAM主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng),在神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化、遷移以及軸突的生長中起著非常重要的作用,但近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn),NCAM和多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[4]。黏附分子和黑色素瘤的關(guān)系近年來引起了更多的關(guān)注,多種黏附分子可以通過介導(dǎo)細(xì)胞間黏附狀態(tài)的變化以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展[5-7],但是,關(guān)于NCAM和黑色素瘤的關(guān)系,目前除了少數(shù)臨床描述性研究結(jié)果以外[8-9],并無其它相關(guān)報道。為此,本研究擬采用小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16-F0為對象,考察NCAM與黑色素瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)性以及其中介導(dǎo)的分子機(jī)制。

    材 料 和 方 法

    1材料

    SPF級雌性C57BL/6J小鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供,動物的飼養(yǎng)和處死均遵循西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會制定的基本動物實驗倫理原則進(jìn)行。小鼠B16-F0黑色素瘤細(xì)胞購置于ATCC細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)材料包括:細(xì)胞培養(yǎng)基高糖DMEM購自Gibco;胎牛血清(fetal calf serum, FCS)購自Invitrogen;NaHCO3購自Sigma;HEPES購自Sigma青、鏈霉素購自Invitrogen。RNA干擾質(zhì)粒pSilencer 4.1-CMV購自Ambion。高表達(dá)β-catenin的質(zhì)粒pβ-catenin為新加坡南洋理工大學(xué)生命科學(xué)院馮志偉教授饋贈。β-catenin的單鏈RNA干擾試劑β-catenin-siRNA (sc-29210)以及相應(yīng)對照siRNA (sc-37007)購自Santa Cruz。Lipofectamine 2000和G418購自 Invitrogen。細(xì)胞增殖MTT試劑盒購自Roche Applied Science。實驗中使用到的Ⅰ抗包括:NCAM(AB5032)購自Millipore;β-catenin (#9562)和p-LRP5/6 (Ser-1490;#2568)購自Cell Signaling Technology;LRP5/6 (sc-57354)購自Santa Cruz;β-actin(A5441)和GAPDH(G8795)購自Sigma。SYBR定量PCR試劑盒購自KAPA Biosystems。

    2方法

    2.1細(xì)胞培養(yǎng) B16-F0細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM中,其中含有10% FCS、20 mmol/L NaHCO3、5 mmol/L HEPES以及 1% 青、鏈霉素,80%融合時傳代。

    2.2質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 選取針對NCAM的特異性靶序列5’-CGA CTT CTT TGG CCA CTA TAC-3’,把針對靶序列的能產(chǎn)生穩(wěn)定小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA, shRNA)的DNA序列克隆入RNA干擾質(zhì)粒pSilencer 4.1-CMV中,以打亂后的隨機(jī)序列構(gòu)建的Scrambled shRNA為對照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000的說明書進(jìn)行操作。穩(wěn)定表達(dá)NCAM shRNA(shNCAM)和scrambled shRNA(sh-CTRL)的細(xì)胞系用800 mg/L G418篩選。轉(zhuǎn)染后6 h更換新鮮培養(yǎng)液,然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞用于下一步實驗。

    2.3細(xì)胞增殖實驗 B16-F0細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中,接種密度為2 000 cells/well,培養(yǎng)時間96 h。細(xì)胞的相對增殖率使用具體方法為,收集各時點的細(xì)胞用含有MTT的新鮮培養(yǎng)液孵育4 h,然后在相應(yīng)溶解液中孵育過夜后,在Tecan GENios測量儀上于570 nm下測量吸光度。實驗均重復(fù)3次,取均值。

    2.4軟瓊脂克隆實驗 在60 mm培養(yǎng)皿中,2×104個腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含0.3% 瓊脂和10% FCS的高糖DMEM培養(yǎng)液中,其中培養(yǎng)皿預(yù)先用含0.35%瓊脂的DMEM培養(yǎng)液包被。細(xì)胞克隆在14 d后用0.5%的結(jié)晶紫染色計數(shù)。實驗重復(fù)3次取均值。

    2.5皮下黑色素瘤動物模型 12只雌性C57BL/6J小鼠(6~8周,15~20 g)隨機(jī)分為2組,每組6只,分別在背部皮下注射7.5×105個穩(wěn)定表達(dá)shNCAM或shCTRL的B16-F0黑色素瘤細(xì)胞,間隔2 d觀察皮下腫瘤的生長情況,3周后脫頸處死動物,分離皮下的腫瘤并測量腫瘤大小和重量。

    2.6免疫印跡 細(xì)胞在裂解液(50 mmol/L Tris,100 mmol/L NaCl,5 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA,5 mmol/L MgCl2,1% Triton X-100,1%甘油以及1×的蛋白酶抑制劑)中置于冰上裂解1 h,15 000×g、4 ℃離心15 min,收集上清蛋白液。蛋白液測量濃度后,取20~40 μg蛋白使用SDS-PAGE分離,然后把蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。其后使用5%的脫脂牛奶封閉1 h后,與含有第Ⅰ抗體的5%脫脂牛奶在4 ℃孵育過夜,PBST清洗后,再與HRP偶聯(lián)的第Ⅱ抗體孵育1 h。此后加入反應(yīng)發(fā)光液進(jìn)行信號采集(Immobilon Western Chemiluminescent HRP底物系統(tǒng),購自Millipore)。實驗均重復(fù)3次。

    2.7實時熒光定量PCR 遵照KAPA SYBR定量PCR說明書進(jìn)行,95 ℃預(yù)變性20 s,然后運行40個PCR循環(huán),每個循環(huán)95 ℃ 3 s,60 ℃ 1 min。使用的引物序列為:Wnt3A 正義鏈5’-CTC CTC TCG GAT ACC TCT TAG TG-3’,反義鏈5’-GCA TGA TCT CCA CGT AGT TCC TG-3’;LRP5正義鏈5’-AAG GGT GCT GTG TAC TGG AC-3’,反義鏈5’-AGA AGA GAA CCT TAC GGG ACG-3;LRP6正義鏈5’-TTG TTG CTT TAT GCA AAC AGA CG-3’,反義鏈5’-GTT CGT TTA ATG GCT TCT TCG C-3’;Frizzled7 正義鏈5’-CGG GGC CTC AAG GAG AGA A-3’,反義鏈5’-GTC CCC TAA ACC GAG CCA G-3’;Frizzled8(正義鏈5’-ATG GAG TGG GGT TAC CTG TTG-3’,反義鏈5’-CAC CGT GAT CTC TTG GCA C-3’。

    3統(tǒng)計學(xué)處理

    數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間比較使用SPSS 17.0采用t檢驗以及方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1NCAM基因沉默顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞B16-F0的增殖

    使用針對NCAM的能夠產(chǎn)生shRNA的干擾質(zhì)粒pSilencer 4.1-CMV-CAM轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,篩選出穩(wěn)定表達(dá)shRNA的細(xì)胞系shNCAM,Western blotting顯示該細(xì)胞NCAM的表達(dá)水平明顯受到抑制,見圖1A。MTT細(xì)胞增殖實驗表明,在NCAM沉默后,細(xì)胞的生長速度明顯下降(P<0.05),見圖1B。同時,軟瓊脂克隆實驗顯示在NCAM沉默后,腫瘤細(xì)胞形成克隆的大小和數(shù)目均受到顯著性抑制(P<0.05),見圖1C、D。為了排除NCAM沉默后細(xì)胞總數(shù)目的降低可能由于凋亡增加引起,我們同時對比了兩種細(xì)胞的凋亡比例,發(fā)現(xiàn)NCAM沉默對B16-F0細(xì)胞的凋亡并沒有顯著影響。這些結(jié)果提示,NCAM具有促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞B16-F0增殖的作用。

    Figure 1.NCAMsilencing inhibited the proliferation of B16-F0 cells. A: NCAM protein expression determined by Western blotting; B: cell proliferation detected by MTT assay; C: colony formation observed under microscope (crystal violet staining, scale bar=100 μm). Mean±SD.n=6 in B;n=9 in C.*P<0.05vsshCTRL.

    圖1NCAM基因沉默抑制B16-F0細(xì)胞的增殖

    2NCAM基因沉默顯著抑制B16-F0黑色素瘤在小鼠皮下的生長

    分別在C57BL/6J小鼠皮下接種shCTRL野生型和shNCAM細(xì)胞,3周以后的結(jié)果表明,相比對照組,NCAM沉默的B16-F0細(xì)胞在皮下的生長受到顯著抑制,見圖2A,解剖分離出的腫瘤的大小和重量均存在顯著差異,shNCAM細(xì)胞形成的腫瘤大小和重量均顯著小于對照組(P<0.05),見圖2B、C。以上的離體細(xì)胞培養(yǎng)和在體動物實驗均表明,NCAM對于黑色素瘤細(xì)胞B16-F0的增殖具有顯著促進(jìn)作用,而下調(diào)NCAM的表達(dá)水平即可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長。

    Figure 2.NCAMsilencing inhibited the growth of melanoma in mice. B16-F0 cells were subcutaneously transplanted into the back of C57BL/6J mice. A: representative mice 3 weeks after transplantation, with arrows indicating the subcutaneous melanoma; B: the size of the tumors; C: the weight of the tumors. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsshCTRL.

    圖2NCAM基因沉默抑制小鼠黑色素瘤的生長

    3NCAM通過β-catenin調(diào)控B16-F0細(xì)胞的增殖

    NCAM沉默后,β-catenin水平明顯降低,見圖3A。β-catenin的下調(diào)能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖水平,見圖3B;高表達(dá)β-catenin能夠顯著恢復(fù)shNCAM細(xì)胞的增殖性能,見圖3C。以上實驗結(jié)果說明,NCAM主要通過影響β-catenin而調(diào)控B16-F0細(xì)胞的增殖。

    Figure 3. NCAM regulated the proliferation of B16-F0 cells via β-catenin. A: the expression of total β-catenin and cytosolic β-catenin in B16-F0 cells transfected withNCAMshRNA was detected by Western blotting; B: the proliferation of B16-F0 cells transiently transfected with β-catenin siRNA; C: the proliferation of B16-F0 cells withNCAMsilencing and/or β-catenin overexpression. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsother groups.

    圖3NCAM通過β-catenin調(diào)控B16-F0細(xì)胞的增殖

    4NCAM對β-catenin的調(diào)控不依賴于經(jīng)典的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

    NCAM表達(dá)降低以后,磷酸化LRP5/6并無明顯改變,見圖4A。實時熒光定量 PCR結(jié)果表明受體Frizzled以及Wnt3A的表達(dá)水平均無顯著變化,見圖4B。上述結(jié)果說明,NCAM對于β-catenin的影響并非通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin途徑,可能存在NCAM調(diào)控β-catenin的新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

    Figure 4.NCAMsilencing down-regulated β-catenin expression in B16-F0 cells via a novel pathway independent of canonical Wnt pathway. A: the phosphorylation of LRP5/6 was detected by Western blotting; B: the mRNA levels of Wnt3A and its receptors Frizzled7, Frizzled8, LRP5 and LRP6 were determined by real-time PCR. Mean±SD.n=4.

    圖4NCAM基因沉默并非通過經(jīng)典的Wnt信號通路下調(diào)β-catenin表達(dá)

    討 論

    NCAM是神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)的黏附分子,在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的黏附、增殖、分化、遷移和軸突的生長中起著重要作用。近年的研究發(fā)現(xiàn),NCAM在多種腫瘤的發(fā)展中也起著重要作用,但NCAM和黑色素瘤的關(guān)系目前報道很少。本研究結(jié)果表明,NCAM能夠顯著促進(jìn)小鼠黑色素瘤B16-F0細(xì)胞細(xì)胞的增殖,其中β-catenin為NCAM調(diào)控B16-F0增殖的主要信號分子,而NCAM對于β-catenin的調(diào)控獨立于經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。我們的研究成果闡明了NCAM激發(fā)的信號通路在黑色素瘤的進(jìn)展中所扮演的角色,為黑色素瘤治療方法的發(fā)展提供了更多的基礎(chǔ)研究證據(jù)。

    黑色素細(xì)胞在向黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程中,非常顯著的行為學(xué)改變即是細(xì)胞增殖異常[10],而且細(xì)胞的增殖能力也決定著黑色素瘤的進(jìn)展和預(yù)后。關(guān)于黑色素瘤增殖調(diào)控機(jī)制的研究對于發(fā)展黑色素瘤新的治療方法具有重要的意義。以往的研究已經(jīng)揭示出NCAM參與了多種腫瘤的進(jìn)展。我們的前期研究曾發(fā)現(xiàn)NCAM能夠促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[11],在本研究中,我們進(jìn)一步揭示出NCAM能夠促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖,在黑色素瘤細(xì)胞B16-F0中沉默NCAM能夠顯著抑制黑色素瘤的生長,包括其增殖能力、克隆形成能力以及腫瘤的生長速度均得到抑制。近期的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),除了NCAM,其它免疫球蛋白超家族類的黏附分子,比如黏附分子CD171[12]和CD146[6]均能夠促進(jìn)黑色素瘤的進(jìn)展。上述的結(jié)果揭示,黏附分子也許可以作為黑色素瘤進(jìn)展的一個標(biāo)志物。

    NCAM不僅僅介導(dǎo)黏附,同時還可以激活多種信號通路,包括與黑色素瘤進(jìn)展密切關(guān)聯(lián)的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinosiol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)通路[13]。但是,在我們的研究中,并沒有發(fā)現(xiàn)這兩條經(jīng)典信號通路參與了NCAM促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們的實驗表明,β-catenin為NCAM調(diào)控B16-F0細(xì)胞增殖的中心分子。以往的研究曾經(jīng)報道過β-catenin信號通路可以促進(jìn)或者抑制黑色素瘤的進(jìn)展,比如Chien等[14]發(fā)現(xiàn)Wnt3分子能夠通過提高β-catenin水平而抑制B16-F0細(xì)胞的增殖,這個結(jié)論似乎和我們的研究結(jié)果存在矛盾。不過在他們的實驗中,使用RNA干擾降低β-catenin的水平卻不能夠改善Wnt3分子對于黑色素瘤細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng),顯然Wnt分子和β-catenin對于黑色素瘤增殖的影響并不一致。而在本研究中,我們是同時進(jìn)行β-catenin的上調(diào)和下調(diào)來觀察其對于黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響,能夠更有力地說明NCAM是通過β-catenin促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖。

    β-catenin是經(jīng)典Wnt通路的中心分子,在缺乏Wnt分子的刺激下,β-catenin在蛋白復(fù)合體中被糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)持續(xù)磷酸化而不具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[15]。當(dāng)Wnt分子結(jié)合到受體Frizzled和LRP5/6后,抑制β-catenin的GSK-3β即脫離蛋白復(fù)合體,釋放出的游離β-catenin即可以進(jìn)入細(xì)胞核而激活相應(yīng)的基因表達(dá)。在經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路中,β-catenin的上調(diào)總是伴隨著Wnt分子和其受體的表達(dá)增加以及受體LRP5/6的磷酸化。但是,在NCAM激活β-catenin的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中,我們的實驗結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)同時并存的表達(dá)上調(diào)的Wnt分子和其受體Frizzled,也沒有發(fā)現(xiàn)LRP5/6磷酸化水平的升高。顯然,NCAM對于β-catenin的調(diào)控不依賴于經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路,在NCAM到β-catenin的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)上,應(yīng)該存在著一條新的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,使NCAM可以通過調(diào)控β-catenin的水平控制黑色素瘤細(xì)胞的增殖。

    總之,我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了NCAM通過調(diào)控β-catenin而促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖,而NCAM對于β-catenin信號的影響?yīng)毩⒂诮?jīng)典的Wnt通路。我們的研究揭示了NCAM在黑色素瘤增殖中所起的作用,同時豐富了β-catenin為基礎(chǔ)的信號通路系統(tǒng)。鑒于NCAM的抗體已經(jīng)用于NCAM高表達(dá)腫瘤的臨床試驗中[16-17],而且拮抗NCAM的多肽也正處在積極的開發(fā)階段[18],我們的成果為研究黑色素瘤新的治療方法提供了一個值得參考的靶點。

    [1] Gray-Schopfer V, Wellbrock C, Marais R. Melanoma biology and new targeted therapy [J].Nature, 2007, 445(7130):851-857.

    [2] CSCO黑色素瘤專家委員會. 中國黑色素瘤診治指南(2011版)[J]. 臨床腫瘤學(xué)雜志,2012,17(2):159-171.

    [3] Chapman PB, Hauschild A, Robert C, et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation [J]. N Engl J Med, 2011, 364(26):2507-2516.

    [4] Zecchini S, Cavallaro U. Neural cell adhesion molecule in cancer: expression and mechanisms [J]. Adv Exp Med Biol, 2010, 663:319-333.

    [5] van Kilsdonk JW, Wilting RH, Bergers M, et al. Attenuation of melanoma invasion by a secreted variant of activated leukocyte cell adhesion molecule [J]. Cancer Res, 2008, 68(10):3671-3679.

    [6] Todorovic V, Sersa G, Cemazar M. Gene electrotransfer of siRNAs against CD146 inhibits migration and invasion of human malignant melanoma cells SK-MEL28 [J]. Cancer Gene Ther, 2013, 20(3):208-210.

    [7] Jannie KM, Stipp CS, Weiner JA. ALCAM regulates motility, invasiveness, and adherens junction formation in uveal melanoma cells [J]. PLoS One, 2012, 7(6):e39330.

    [8] Mooy CM, Luyten GP, de Jong PT, et al. Neural cell adhesion molecule distribution in primary and metastatic uveal melanoma [J]. Hum Pathol, 1995, 26(11):1185-1190.

    [9] Geertsen R, Zenklusen R, Kamarashev J, et al. Inverse regulation of neuronal cellular adhesion molecule (NCAM) by IFN-γ in melanoma cell cultures established from CNS lesions [J]. Int J Cancer, 1999, 83(1):135-140.

    [10] 祝和成, 吳尚輝, 黃柏英, 等. 8株人黑色素瘤細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性研究[J]. 中國病理生理雜志, 2005, 21(2): 276-280.

    [11] Shi Y, Liu R, Zhang S, et al. Neural cell adhesion molecule potentiates invasion and metastasis of melanoma cells through cAMP-dependent protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase pathways [J]. Int J Biochem Cell Biol, 2011, 43(4):682-690.

    [12] Meier F, Busch S, Gast D, et al. The adhesion molecule L1 (CD171) promotes melanoma progression [J]. Int J Cancer, 2006, 119(3):549-555.

    [13] Maness PF, Schachner M. Neural recognition molecules of the immunoglobulin superfamily: signaling transducers of axon guidance and neuronal migration [J]. Nat Neurosci, 2007, 10(1):19-26.

    [14] Chien AJ, Moore EC, Lonsdorf AS, et al. Activated Wnt/β-catenin signaling in melanoma is associated with decreased proliferation in patient tumors and a murine melanoma model [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(4):1193-1198.

    [15] Kimelman D, Xu W. β-catenin destruction complex: insights and questions from a structural perspective [J]. Oncogene, 2006, 25(57):7482-7491.

    [16] Jensen M, Berthold F. Targeting the neural cell adhesion molecule in cancer [J]. Cancer Lett, 2007, 258(1):9-21.

    [17] Smith SV. Technology evaluation: huN901-DM1, ImmunoGen [J]. Curr Opin Mol Ther, 2005, 7(4):394-401.

    [18] Berezin V, Bock E. NCAM mimetic peptides: an update [J]. Adv Exp Med Biol, 2010, 663:337-353.

    NeuralcelladhesionmoleculepromotesproliferationofmousemelanomaB16-F0cellsviaβ-cateninindependentofcanonicalWntpathway

    LIU Rui1, HAO Chun-yuan2, DENG Xiu-ling1, YANG Yu-bai1

    (1DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,MedicalSchool,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofCardiology,Xi’anNo. 1Hospital,Xi’an710002,China.E-mail:dr.liurui@gmail.com)

    AIM: To investigate the effects of neural cell adhesion molecule (NCAM) on the proliferation of mouse melanoma B16-F0 cells, and to further explore the involved signaling pathways.METHODSRNA interference was used to silence the expression ofNCAMin B16-F0 cells, followd by MTT and soft agar assays to evaluate the proliferation. Subcutaneous transplatation ofNCAM-silencing B16-F0 cells into C57BL/6J mice was performed, and the tumor growthinvivowas observed. Western blotting was used to clarify the involved signaling pathways.RESULTSThe proliferation and colony formation of B16-F0 cellsinvitroand the growth of transplanted melanomainvivowere significantly inhibited byNCAMsiRNA. Interestingly, the change of NCAM expression level markedly regulated the activity of β-catenin, and this signaling pathway was independent of canonical Wnt pathway.CONCLUSIONOur findings reveal a novel regulatory role of NCAM in the progression of melanoma, which might serve as a new therapeutic target for the treatment of melanoma.

    Neural cell adhesion molecules; Melanoma; β-catenin; Cell proliferation

    R739.5

    A

    1000- 4718(2013)09- 1645- 06

    2013- 05- 14

    2013- 07- 09

    △通迅作者Tel: 029-82655164; E-mail: dr.liurui@gmail.com

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.019

    猜你喜歡
    信號轉(zhuǎn)導(dǎo)黑色素瘤調(diào)控
    Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在瘢痕疙瘩形成中的作用機(jī)制研究
    如何調(diào)控困意
    經(jīng)濟(jì)穩(wěn)中有進(jìn) 調(diào)控托而不舉
    中國外匯(2019年15期)2019-10-14 01:00:34
    原發(fā)性食管惡性黑色素瘤1例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    順勢而導(dǎo) 靈活調(diào)控
    顱內(nèi)黑色素瘤的研究進(jìn)展
    左拇指巨大黑色素瘤1例
    SUMO修飾在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用
    HGF/c—Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用
    鈣敏感受體及其與MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系
    一级毛片aaaaaa免费看小| av网站免费在线观看视频| 日韩精品有码人妻一区| 免费观看无遮挡的男女| 晚上一个人看的免费电影| 久久亚洲国产成人精品v| 国产成人精品久久久久久| 精品国产三级普通话版| 六月丁香七月| 又爽又黄a免费视频| 大香蕉久久网| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 免费看av在线观看网站| 免费看光身美女| 亚洲精品,欧美精品| 欧美另类一区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产免费又黄又爽又色| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久久成人免费电影| 99久久精品热视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| av国产精品久久久久影院| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产爽快片一区二区三区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 午夜视频国产福利| 亚洲自拍偷在线| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 欧美最新免费一区二区三区| 看非洲黑人一级黄片| 色视频在线一区二区三区| 久久人人爽人人片av| 成人欧美大片| 只有这里有精品99| 国产高清有码在线观看视频| 国产精品久久久久久久久免| 国产精品一区二区在线观看99| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 69人妻影院| 亚洲精品456在线播放app| 日韩成人伦理影院| 免费看a级黄色片| 搡老乐熟女国产| 免费黄色在线免费观看| 高清视频免费观看一区二区| 日本色播在线视频| 欧美zozozo另类| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 特级一级黄色大片| 亚洲天堂av无毛| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产视频内射| 少妇高潮的动态图| 亚洲av男天堂| 亚洲综合精品二区| 在线观看人妻少妇| 日韩欧美 国产精品| 国产精品人妻久久久影院| 日本一二三区视频观看| 男女无遮挡免费网站观看| av在线蜜桃| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产乱来视频区| 欧美日本视频| 国产一区二区在线观看日韩| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产综合懂色| 日韩欧美 国产精品| 色哟哟·www| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 黄色配什么色好看| 一本色道久久久久久精品综合| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 国产成人精品久久久久久| 高清av免费在线| 在线免费十八禁| 少妇的逼水好多| 蜜臀久久99精品久久宅男| 中国国产av一级| 久久99热6这里只有精品| 欧美日本视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品熟女少妇av免费看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 另类亚洲欧美激情| 黄片wwwwww| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲国产精品国产精品| kizo精华| 成人美女网站在线观看视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久午夜福利片| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 九色成人免费人妻av| 七月丁香在线播放| 少妇人妻 视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久99精品国语久久久| 国产黄频视频在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 免费看a级黄色片| 看非洲黑人一级黄片| xxx大片免费视频| 成人漫画全彩无遮挡| 一区二区三区乱码不卡18| 男女边吃奶边做爰视频| 91精品国产九色| 白带黄色成豆腐渣| 黑人高潮一二区| 好男人在线观看高清免费视频| 成人午夜精彩视频在线观看| av播播在线观看一区| 丝袜美腿在线中文| 老女人水多毛片| 国产午夜福利久久久久久| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 在线免费十八禁| 欧美变态另类bdsm刘玥| 在线观看一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影小说 | av卡一久久| 婷婷色av中文字幕| 亚洲电影在线观看av| 国产成年人精品一区二区| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久久久久久久久成人| 高清日韩中文字幕在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久久成人免费电影| 久久久久网色| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲av成人精品一二三区| 国产在视频线精品| 中国美白少妇内射xxxbb| 婷婷色综合大香蕉| 麻豆成人午夜福利视频| 不卡视频在线观看欧美| 国产亚洲91精品色在线| 干丝袜人妻中文字幕| 成年版毛片免费区| 少妇的逼好多水| 麻豆乱淫一区二区| 免费大片黄手机在线观看| 免费av毛片视频| 下体分泌物呈黄色| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国国产精品蜜臀av免费| 午夜精品国产一区二区电影 | 一区二区三区四区激情视频| 国产色婷婷99| av免费观看日本| 亚洲高清免费不卡视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲国产av新网站| 久久久久国产精品人妻一区二区| 波野结衣二区三区在线| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 亚洲一区二区三区欧美精品 | 永久网站在线| 69av精品久久久久久| 国产成人精品一,二区| 男的添女的下面高潮视频| 天美传媒精品一区二区| 一级毛片aaaaaa免费看小| 日本色播在线视频| 乱系列少妇在线播放| 91精品一卡2卡3卡4卡| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产亚洲精品久久久com| 国产午夜精品一二区理论片| 99热网站在线观看| 99热全是精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 一级二级三级毛片免费看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 中文天堂在线官网| 91久久精品国产一区二区成人| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲国产精品成人综合色| 国产成人a区在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 卡戴珊不雅视频在线播放| 免费少妇av软件| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 春色校园在线视频观看| 久久久久国产网址| 亚洲最大成人av| 国产在线一区二区三区精| 久久精品人妻少妇| 色播亚洲综合网| 男人添女人高潮全过程视频| 99久久精品热视频| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲精品视频女| 久久韩国三级中文字幕| a级一级毛片免费在线观看| 视频区图区小说| 国产 精品1| 色综合色国产| 舔av片在线| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美日韩精品成人综合77777| 在线 av 中文字幕| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日韩强制内射视频| 男女无遮挡免费网站观看| 黄片wwwwww| 亚洲成人久久爱视频| 色综合色国产| 免费大片18禁| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲怡红院男人天堂| 一级黄片播放器| 最近中文字幕2019免费版| av在线天堂中文字幕| 国产 一区 欧美 日韩| 一区二区三区精品91| 国产在视频线精品| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久6这里有精品| 亚洲丝袜综合中文字幕| 一本色道久久久久久精品综合| 少妇 在线观看| 久久久久久久久久成人| 亚洲精品视频女| 久久国产乱子免费精品| 听说在线观看完整版免费高清| a级毛色黄片| 国产av码专区亚洲av| 色视频在线一区二区三区| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲av成人精品一二三区| 麻豆乱淫一区二区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 丝袜美腿在线中文| 国产成人freesex在线| 精品久久国产蜜桃| 久久精品国产a三级三级三级| av在线观看视频网站免费| 禁无遮挡网站| 在线a可以看的网站| 国产精品精品国产色婷婷| 一级爰片在线观看| 一级毛片 在线播放| 色视频www国产| 制服丝袜香蕉在线| av国产久精品久网站免费入址| 欧美日本视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 成人综合一区亚洲| 日本wwww免费看| 三级国产精品片| 国产在线男女| 久久久国产一区二区| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产 精品1| 高清午夜精品一区二区三区| 六月丁香七月| 看十八女毛片水多多多| 69人妻影院| 人人妻人人看人人澡| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产亚洲5aaaaa淫片| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产精品人妻久久久久久| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 插逼视频在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 内射极品少妇av片p| 夫妻午夜视频| av专区在线播放| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 久久国产乱子免费精品| 麻豆乱淫一区二区| 久久久午夜欧美精品| 老司机影院成人| 国产老妇女一区| 免费观看无遮挡的男女| 黄色配什么色好看| 亚洲,一卡二卡三卡| 看黄色毛片网站| 大码成人一级视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 日韩伦理黄色片| 热re99久久精品国产66热6| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲av免费高清在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品偷伦视频观看了| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 交换朋友夫妻互换小说| 一级a做视频免费观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 人妻 亚洲 视频| 欧美bdsm另类| 嫩草影院新地址| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 日韩成人av中文字幕在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久女婷五月综合色啪小说 | 简卡轻食公司| 麻豆成人av视频| 亚洲av成人精品一二三区| 五月天丁香电影| 国产午夜精品一二区理论片| 国产 一区精品| 久久6这里有精品| 久久久久久久久久久丰满| 麻豆久久精品国产亚洲av| 综合色av麻豆| 欧美极品一区二区三区四区| 永久网站在线| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲国产精品国产精品| 久久久午夜欧美精品| 高清日韩中文字幕在线| 午夜亚洲福利在线播放| 精品久久久噜噜| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 色哟哟·www| 性色av一级| 大话2 男鬼变身卡| 听说在线观看完整版免费高清| 直男gayav资源| 国产精品偷伦视频观看了| 能在线免费看毛片的网站| 久久鲁丝午夜福利片| 丰满乱子伦码专区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 成年女人看的毛片在线观看| 国产亚洲最大av| 中文在线观看免费www的网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 天天躁日日操中文字幕| 国产淫语在线视频| 日日啪夜夜撸| 精品少妇久久久久久888优播| 新久久久久国产一级毛片| 街头女战士在线观看网站| 男人和女人高潮做爰伦理| 在线精品无人区一区二区三 | 国产一区亚洲一区在线观看| 国产色婷婷99| 夫妻午夜视频| 秋霞伦理黄片| 日日撸夜夜添| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲一区二区三区欧美精品 | www.av在线官网国产| 深夜a级毛片| av卡一久久| 亚洲丝袜综合中文字幕| 99热国产这里只有精品6| 精品人妻熟女av久视频| 99re6热这里在线精品视频| 色吧在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 老司机影院毛片| 欧美少妇被猛烈插入视频| 欧美高清性xxxxhd video| 22中文网久久字幕| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 免费少妇av软件| 久久99蜜桃精品久久| 午夜福利视频1000在线观看| 免费看光身美女| 久久久国产一区二区| 99热这里只有精品一区| 亚洲av国产av综合av卡| 一级二级三级毛片免费看| av一本久久久久| 在线免费观看不下载黄p国产| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品av视频在线免费观看| 久久久久九九精品影院| 国产色婷婷99| 欧美日韩在线观看h| 亚洲精品国产色婷婷电影| 女人被狂操c到高潮| 五月开心婷婷网| 视频区图区小说| 日本一二三区视频观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 一区二区av电影网| 青春草国产在线视频| 寂寞人妻少妇视频99o| videossex国产| 99视频精品全部免费 在线| 日韩免费高清中文字幕av| 成年女人看的毛片在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产亚洲5aaaaa淫片| 一级av片app| 黄片wwwwww| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲av免费在线观看| 国产成人精品一,二区| 九色成人免费人妻av| 1000部很黄的大片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 2022亚洲国产成人精品| 国产精品蜜桃在线观看| 精品久久久久久电影网| 精品一区二区三卡| av在线天堂中文字幕| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲综合精品二区| av网站免费在线观看视频| 韩国av在线不卡| 深夜a级毛片| 国产久久久一区二区三区| 久久久久久久久大av| 亚洲av成人精品一区久久| 国国产精品蜜臀av免费| 不卡视频在线观看欧美| 性色avwww在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲精品第二区| 亚洲天堂av无毛| 国产精品一二三区在线看| 成人黄色视频免费在线看| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| av专区在线播放| 青青草视频在线视频观看| 成年版毛片免费区| 在现免费观看毛片| 2021天堂中文幕一二区在线观| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲精品乱久久久久久| kizo精华| 国产精品久久久久久av不卡| 两个人的视频大全免费| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲欧美日韩无卡精品| 一级黄片播放器| 免费av不卡在线播放| 国产高潮美女av| 日韩欧美精品免费久久| .国产精品久久| 免费观看性生交大片5| 内射极品少妇av片p| 嫩草影院新地址| 高清视频免费观看一区二区| 成人特级av手机在线观看| 成人欧美大片| 成人国产av品久久久| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 成人毛片a级毛片在线播放| 插阴视频在线观看视频| 成年版毛片免费区| 视频中文字幕在线观看| 精品久久久噜噜| 久久精品人妻少妇| 亚洲va在线va天堂va国产| 熟女av电影| 久久国产乱子免费精品| 欧美成人一区二区免费高清观看| 青春草视频在线免费观看| 日韩大片免费观看网站| 内地一区二区视频在线| 国产黄色免费在线视频| 丰满少妇做爰视频| 国产有黄有色有爽视频| 插阴视频在线观看视频| 尾随美女入室| 在线观看国产h片| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲精品456在线播放app| 两个人的视频大全免费| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲成色77777| 六月丁香七月| 内射极品少妇av片p| 亚洲av一区综合| 一级黄片播放器| 街头女战士在线观看网站| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产亚洲5aaaaa淫片| 日韩一区二区三区影片| 黄片无遮挡物在线观看| 日本黄色片子视频| 精华霜和精华液先用哪个| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产久久久一区二区三区| 国产成人免费观看mmmm| 最近最新中文字幕大全电影3| 五月玫瑰六月丁香| 成人午夜精彩视频在线观看| 丰满乱子伦码专区| 亚洲人成网站在线观看播放| 日韩强制内射视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 丰满乱子伦码专区| 日韩成人伦理影院| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲性久久影院| 国产精品女同一区二区软件| 少妇高潮的动态图| 97热精品久久久久久| 亚洲av日韩在线播放| 成年人午夜在线观看视频| 日韩一本色道免费dvd| 美女高潮的动态| 最新中文字幕久久久久| 日日啪夜夜爽| 国产伦精品一区二区三区视频9| 真实男女啪啪啪动态图| 九色成人免费人妻av| 在线播放无遮挡| 国精品久久久久久国模美| 免费av不卡在线播放| 亚洲高清免费不卡视频| 免费观看av网站的网址| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产一区二区三区av在线| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 五月开心婷婷网| 久久午夜福利片| 欧美日韩综合久久久久久| 在现免费观看毛片| 亚洲精品亚洲一区二区| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久国产乱子免费精品| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲精品一区蜜桃| 九九爱精品视频在线观看| 久久国产乱子免费精品| 99久久人妻综合| 亚洲国产欧美在线一区| 免费看不卡的av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产黄片美女视频| 春色校园在线视频观看| 身体一侧抽搐| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 一级黄片播放器| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久久久久久精品精品| 人妻一区二区av| 免费观看无遮挡的男女| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 免费观看的影片在线观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 搡女人真爽免费视频火全软件| 99久久人妻综合| 国产成年人精品一区二区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 在线观看免费高清a一片| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产中年淑女户外野战色| 精华霜和精华液先用哪个| 最近最新中文字幕大全电影3| av一本久久久久| 国产黄片美女视频| 国产人妻一区二区三区在| av免费观看日本| 老女人水多毛片| 综合色av麻豆| 国产黄片美女视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美高清性xxxxhd video| 亚州av有码| 国产成人一区二区在线| 亚洲精品影视一区二区三区av| 两个人的视频大全免费| 啦啦啦啦在线视频资源| av免费在线看不卡| 精品视频人人做人人爽| 亚洲av一区综合| 在线天堂最新版资源| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 一区二区三区四区激情视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 午夜爱爱视频在线播放| av免费观看日本| 亚洲av成人精品一区久久| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 国产男人的电影天堂91| 久久久欧美国产精品| 久久久久久九九精品二区国产| 好男人在线观看高清免费视频| 成人黄色视频免费在线看|