細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制研究*

李航宇， 李 巖， 劉 丹， 孫宏治， 劉金鋼△

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院普通外科，遼寧 沈陽(yáng) 110004； 2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科，遼寧 錦州 121001)

細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制研究*

李航宇1， 李 巖1， 劉 丹1， 孫宏治2， 劉金鋼1△

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院普通外科，遼寧 沈陽(yáng) 110004；2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科，遼寧 錦州 121001)

目的探討細(xì)胞外熱休克蛋白70(HSP70)/HSP70肽復(fù)合物(HSP70-PCs)對(duì)肝癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響和可能機(jī)制。方法將HepG2細(xì)胞分為3組：正常對(duì)照組、HSP70/HSP70-PCs組(終濃度2 mg/L)和LY294002+HSP70/HSP70-PCs組。應(yīng)用real-time RT-PCR與Western blotting法檢測(cè)上皮細(xì)胞表面標(biāo)志E-cadherin和間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)變化，以及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1-α)的表達(dá)變化。結(jié)果細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞EMT的發(fā)生。HepG2細(xì)胞的EMT過(guò)程伴隨HIF-1α和PI3K表達(dá)增加。應(yīng)用LY294002阻斷PI3K后，HepG2細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生EMT，同時(shí)細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs上調(diào)HIF-1α表達(dá)的作用消失。結(jié)論細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs可以通過(guò)PI3K/HIF-1α促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化； HepG2細(xì)胞； 熱休克蛋白70

在肝癌的發(fā)生、進(jìn)展中存在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial-mesenchymal transition，EMT) 現(xiàn)象，并且與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[1]。EMT是指上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的復(fù)雜過(guò)程，在此過(guò)程中上皮細(xì)胞的極性消失、遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，同時(shí)伴有上皮細(xì)胞標(biāo)志物的丟失和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的過(guò)度表達(dá)。EMT的重要標(biāo)志是上皮細(xì)胞表型穩(wěn)定物質(zhì)表達(dá)缺失，如上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)，和(或)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)增加，如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)[2]。熱休克蛋白70(heat-shock protein 70，HSP70)是一組生物體內(nèi)普遍存在、進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)家族，腫瘤細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的熱休克蛋白可以調(diào)控腫瘤的多種生物學(xué)行為[3]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，HSP70不僅在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，細(xì)胞內(nèi)HSP70及HSP70肽復(fù)合物(HSP70-peptide complexes，HSP70-PCs)可以通過(guò)多種方式被釋放到細(xì)胞外[4]。進(jìn)入腫瘤微環(huán)境的HSP70/HSP70-PCs發(fā)揮重要而復(fù)雜的作用，一方面可以活化免疫細(xì)胞參與腫瘤免疫殺傷，另一方面又可能調(diào)控腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[5]。更為引人注目的是細(xì)胞外HSP70/ HSP70-PCs可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為[6]。但是目前關(guān)于細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs參與腫瘤細(xì)胞的EMT尚不明確。

缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)是缺氧條件下存在于哺乳動(dòng)物或人體內(nèi)，介導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)于缺氧微環(huán)境的轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控因子，與多種腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)[7]。目前關(guān)于HSP70與HIF-1α之間關(guān)系在肝癌中少有研究。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲等密切相關(guān)并能調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白介導(dǎo)肝癌的侵襲[8]。我們前期的研究顯示細(xì)胞外HSP70-PCs能夠活化肝癌細(xì)胞PI3K/Akt通路，那么細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs是否是通過(guò)PI3K/Akt通路調(diào)控HIF-1α蛋白介導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生值得研究。本研究應(yīng)用細(xì)胞外HSP70-PCs對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行體外干預(yù)，探討其對(duì)EMT機(jī)制的影響并為臨床防治肝癌尋找治療的靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2來(lái)源于American Type Culture Collection (ATCC)。多克隆小鼠抗人E-cadherin抗體和多克隆小鼠抗人α-SMA抗體均購(gòu)自Abcam;多克隆鼠抗人HIF-1α抗體和多克隆鼠抗人PI3K抗體購(gòu)自Santa Cruz;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)于武漢博士德生物有限公司; RNA提取試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司; RNA PCR Kit購(gòu)自Promega;PI3K抑制劑LY294002購(gòu)自Sigma。

2方法

2.1細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs的提取純化 采用隋春陽(yáng)等[6]的方法進(jìn)行細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs的提取純化,並用Western blotting法鑒定。

2.2實(shí)驗(yàn)分組 HepG2細(xì)胞在含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2培養(yǎng)，2～3 d用0.25%胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分3組：正常對(duì)照組、細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs(終濃度2 mg/L)組和LY294002+細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs處理組。各組于培養(yǎng)后的24 h檢測(cè)。

2.3E-cadherin、α-SMA、PI3K與HIF-1α mRNA表達(dá)的檢測(cè) 按說(shuō)明書提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定 RNA 濃度和純度并根據(jù)總RNA 濃度按說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)合成cDNA，共20 μL。引物序列由北京鼎國(guó)生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，E-cadherin正向引物5’-CCGCCATCGCTTACA- 3’,反向引物5’-GGCACCTGACCCTTGTA-3’；α-SMA正向引物5’-CGGGACATCAAGGAGAAACT-3’；反向引物5’-CCATCAGGCAACTCGTAACTCT-3’；GAPDH正向引物5’-GGATTTGGTCGTATTGGG-3’；反向引物5’-TCGCTCCTGGAAGATGG-3’；HIF-1α正向引物5’-CTTCTGGATGCTGGTG-3’；反向引物5’-TCGGCTAGTTAGGGTAC-3’。反應(yīng)條件：兩步法，第1步: 95 ℃ 3 min;第2步：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：以0.5 ℃/s變化速度從65 ℃到95 ℃每隔5 s計(jì)算1次熒光值。采用相對(duì)定量法，測(cè)定目的基因、校對(duì)基因及GAPDH的PCR產(chǎn)物的Ct值，代入公式 2-ΔΔCt×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.4E-cadherin、α-SMA、PI3K與HIF-1α蛋白表達(dá)的檢測(cè) 按分子克隆方法提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng) Bradford法測(cè)定蛋白濃度；各組取 60～100 g 總蛋白進(jìn)行 100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色標(biāo)記，100 g/L脫脂奶粉于室溫封閉2 h，50 g/L脫脂奶粉稀釋I抗，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST室溫?fù)u洗3次，10～15 min；50 mL/L脫脂奶粉稀釋HRP標(biāo)記的II抗，于室溫孵育2 h，TBST搖洗3次，每次10～15 min；ECL顯色。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs的純化

細(xì)胞裂解液經(jīng)伴刀豆球蛋白A(concanavalin A,Con A)-Sepharpse 4B層析后，分為Con A結(jié)合部分和不結(jié)合部分，不結(jié)合部分經(jīng)電泳后在70 kD處有一淡染條帶(圖1A)。將Con A不結(jié)合部分進(jìn)一步用DEAE柱進(jìn)行分離，梯度鹽洗脫，收集不同洗脫峰的蛋白，將收集的蛋白用特異性Western blotting法鑒定，證實(shí)該蛋白確實(shí)為HSP70(圖1B)。

Figure 1. Purification and identification of extracellular HSP70/HSP70-PCs. A: SDS-PAGE analysis of the purified extracellular HSP70/HSP70-PCs. M:marker; 1:total protein; 2:after Con A separation; 3:after DEAE separation. B: HSP70 was confirmed by Western blotting.

圖1Westernblotting檢測(cè)細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs的表達(dá)

2細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞EMT的發(fā)生

Real-time RT-PCR結(jié)果顯示,HSP70-PCs處理組E-cadherin mRNA的表達(dá)顯著降低，而間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物α-SMA mRNA的表達(dá)顯著升高,見(jiàn)圖2。Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，經(jīng)過(guò)2 mg/L HSP70-PCs處理的HepG2細(xì)胞中上皮標(biāo)志物 E-cadherin蛋白的表達(dá)顯著降低，而間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物α-SMA蛋白的表達(dá)顯著升高,見(jiàn)圖3。以上結(jié)果提示,經(jīng)過(guò)HSP70-PCs處理后，HepG2細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)逐漸消失，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)逐漸增加，HepG2細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生 EMT。

3HepG2細(xì)胞的EMT過(guò)程伴隨HIF-1α和PI3K表達(dá)增加

Real-time RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs處理發(fā)生EMT的HepG2細(xì)胞中HIF-1α與PI3K的mRNA 表達(dá)增加，顯著高于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)圖4。Western blotting結(jié)果顯示，經(jīng)細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs處理發(fā)生EMT的HepG2細(xì)胞中HIF-1α與PI3K蛋白表達(dá)顯著增加，顯著高于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)圖5。

Figure 2. Effects of extracellular HSP70/HSP70-PCs on E-cadherin (A) and α-SMA (B) mRNA expression in HepG2 cells detected by real-time RT-PCR.Mean±SD.n=3．*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs處理后HepG2細(xì)胞中E-cadherin及α-SMAmRNA的表達(dá)

4細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs通過(guò)PI3K調(diào)控HIF-1α表達(dá)影響HepG2細(xì)胞EMT過(guò)程

經(jīng)過(guò)PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理后的HepG2細(xì)胞，在細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs的作用下沒(méi)有發(fā)生EMT。HSP70/HSP70-PCs下調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)和上調(diào)SMA蛋白表達(dá)的作用消失,與對(duì)照組相比，E-cadherin蛋白和SMA蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯變化。同時(shí)，應(yīng)用LY294002特異性阻斷PI3K后，HIF-1α蛋白的上調(diào)表達(dá)亦消失,見(jiàn)圖6。此結(jié)果說(shuō)明，細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs促進(jìn)HepG2 EMT是通過(guò)PI3K和HIF-1α來(lái)實(shí)現(xiàn)的。而且，HIF-1α位于PI3K的下游，可以通過(guò)阻斷PI3K抑制細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs對(duì)HIF-1α表達(dá)的影響。

Figure 3. Effects of extracellular HSP70/HSP70-PCs on E-cadherin and α-SMA protein expression in HepG2 cells detected by Western blotting.Mean±SD．n=3．**P<0.01vscontrol group．

圖3細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs處理后HepG2細(xì)胞中E-cadherin及α-SMA蛋白的表達(dá)

Figure 4. Effects of extracellular HSP70/HSP70-PCs on HIF-1α (A) and PI3K (B) mRNA expression in HepG2 cells.Mean±SD.n=3．**P<0.01vscontrol group.

圖4細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs處理后HepG2細(xì)胞中HIF-1α和PI3KmRNA的表達(dá)

Figure 5. Effects of extracellular HSP70/HSP70-PCs on HIF-1α and PI3K protein expression in HepG2 cells detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖5細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs處理后HepG2細(xì)胞中HIF-1α和PI3K蛋白的表達(dá)

Figure 6. Effects of LY294002 on extracellular HSP70/HSP70-PCs-induced E-cadherin,α-SMA,HIF-1α and PI3K protein expression in HepG2 cells detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol (without treatment);*P<0.05vsHSP70/HSP70-PCs alone.

圖6HSP70/HSP70-PCs處理與PI3K阻斷后的HepG2細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、HIF-1α和PI3K的表達(dá)

討 論

惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過(guò)程極其復(fù)雜，包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)降解、腫瘤血管生成、機(jī)體免疫等多個(gè)環(huán)節(jié)[9]。EMT系指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的分子基礎(chǔ)[10]。腫瘤細(xì)胞經(jīng)EMT 轉(zhuǎn)化后，上皮表型E-cadherin表達(dá)下調(diào)或缺失是其重要標(biāo)志，同時(shí)可引起間充質(zhì)表型α-SMA表達(dá)的上調(diào)[11]。因此可以依靠檢測(cè)這兩類細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物來(lái)鑒定EMT的發(fā)生。

HSP70是在生物體內(nèi)普遍存在的蛋白質(zhì)家族。腫瘤組織中的HSP70/HSP70-PCs不僅存在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，還可以通過(guò)胞吐、分泌和腫瘤細(xì)胞壞死裂解等方式釋放到細(xì)胞外[12]。體外研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs在腫瘤進(jìn)展的不同階段發(fā)揮復(fù)雜而矛盾的作用。在腫瘤的早期階段，細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs可以通過(guò)活化免疫抑制腫瘤的生長(zhǎng)；在腫瘤的晚期，存在于腫瘤微環(huán)境中的HSP70/HSP70-PCs通過(guò)免疫抑制促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[13]。Walsh等[14]的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs還能直接作用于腫瘤細(xì)胞調(diào)控其侵襲等生物學(xué)行為。目前尚未有文獻(xiàn)明確報(bào)道細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs對(duì)腫瘤細(xì)胞的EMT有影響。為此，我們?cè)诟伟┘?xì)胞系HepG2的體外培養(yǎng)過(guò)程中加入從人肝癌組織標(biāo)本中提取并純化的HSP70/HSP70-PCs，觀察HepG2細(xì)胞是否發(fā)生EMT。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs的刺激下， HepG2細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin消失，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志α-SMA表達(dá)增加，使其獲得間充質(zhì)化表型。也就說(shuō)肝癌細(xì)胞HepG2在細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs的誘導(dǎo)下會(huì)發(fā)生EMT。

細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs是通過(guò)何種方式調(diào)控肝癌細(xì)胞EMT發(fā)生的呢？通過(guò)檢索文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其下游的HIF-1α可能參與其中。 PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛存在于細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[15]。PI3K/Akt信號(hào)通路可以感受腫瘤微環(huán)境中多種因素的刺激，調(diào)控腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，促進(jìn)其增殖及侵襲力[8]。腫瘤病灶的一個(gè)主要特征是腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)并伴缺氧微環(huán)境的形成[16]。在缺氧條件下，腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)一系列缺氧適應(yīng)性反應(yīng)，其中就包括HIF-1相關(guān)的基因誘導(dǎo)[7]。HIF-1由α和β亞基組成，其中HIF-1α是受氧分子調(diào)節(jié)的主要功能亞基。人體腫瘤組織中HIF-1α高水平表達(dá)，表達(dá)程度與腫瘤的進(jìn)展程度、轉(zhuǎn)移和放/化療抵抗力呈正相關(guān)。研究表明，HIF-1α高表達(dá)能引起卵巢癌、前列腺癌、膽囊癌、肝細(xì)胞癌等多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT特征的轉(zhuǎn)變，提高其侵襲轉(zhuǎn)移能力[17]。Krishnamachary 等[17]發(fā)現(xiàn)HIF-1α是腫瘤細(xì)胞EMT 的一個(gè)重要信號(hào)，HIF-1α高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生E-cadherin等上皮標(biāo)志丟失和α-SMA等充間質(zhì)標(biāo)志獲得的EMT 改變。我們通過(guò)real-time RT-PCR與Western blotting證實(shí)，在細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs誘導(dǎo)HepG2 EMT的同時(shí)，PI3K與HIF-1α在mRNA和蛋白水平的表達(dá)明顯上調(diào)，說(shuō)明二者可能參與了細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs誘導(dǎo)HepG2 EMT的過(guò)程。進(jìn)一步的阻斷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PI3K抑制劑能有效阻斷細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs誘導(dǎo)的HIF-1α蛋白的表達(dá)，并且EMT標(biāo)志性蛋白分子變化發(fā)生逆轉(zhuǎn)。該結(jié)果提示細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT改變可能是通過(guò)PI3K調(diào)控HIF-1α發(fā)揮作用。

綜上所述，細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs對(duì)肝癌的EMT起著重要作用，這種作用是通過(guò)PI3K/HIF-1α途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果為肝癌侵襲的發(fā)病機(jī)制和防治研究提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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EffectofextracellularHSP70/HSP70-PCsonepithelial-mesenchymaltransitionofhumanhepatocellularcarcinomaHepG2cells

LI Hang-yu1, LI Yan1, LIU Dan1, SUN Hong-zhi2, LIU Jin-gang1

(1DepartmentofGeneralSurgery,ShengjingHospitalAffiliatedtoChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China;2DepartmentofGeneralSurgery,theFirstHospitalAffiliatedtoLiaoningMedicalCollege,Jinzhou121001,China.E-mail:liujg@sj-hospital.org)

AIM: To investigate the effect of extracellular heat-shock protein 70 (HSP70)/HSP70-peptide complexes (HSP70-PCs) on epithelial-mesenchymal transition (EMT) of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells and its probable mechanism.METHODSHepG2 cells were divided into 3 groups: control group, HSP70/HSP70-PCs (2 mg/L) group and LY294002+HSP70/HSP70-PCs group. The mRNA and protein expression of epithelial cell surface marker E-cadherin, mesenchymal cell surface marker α-smooth muscle actin (α-SMA), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) was examined by real-time RT-PCR and Western blotting.RESULTSExtracellular HSP70/HSP70-PCs promoted the initiation of EMT of HepG2 cells. The expression of HIF-1α and PI3K significantly increased in the process of EMT of HepG2 cells. After PI3K was blocked by LY294002, EMT did not occur and HIF-1α was not up-regulated in HepG2 cells.CONCLUSIONExtracellular HSP70/HSP70-PCs may promote EMT of hepatocellular carcinoma cells via PI3K/HIF-1α signaling pathway.

Epithelial-mesenchymal transition; HepG2 cells; Heat-shock protein 70

R735.7

A

1000- 4718(2013)09- 1631- 06

2013- 03- 27

2013- 06- 26

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81071955)；遼寧省教育廳科技項(xiàng)目計(jì)劃(No.L2010634)

△通訊作者Tel： 024-96615-31611; E-mail: liujg@sj-hospital.org

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.016