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    siRNA靶向干擾組蛋白H3表達(dá)對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖的抑制作用*

    2013-10-24 01:44:28李彬彬黃國(guó)良董子明何志巍
    中國(guó)病理生理雜志 2013年9期
    關(guān)鍵詞:鼻咽癌空白對(duì)照克隆

    李彬彬, 黃國(guó)良, 孔 霞, 李 蓉, 董子明, 何志巍,△

    (廣東醫(yī)學(xué)院 1病理生理學(xué)教研室, 2廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 東莞 523808;3鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,河南 鄭州 450001)

    siRNA靶向干擾組蛋白H3表達(dá)對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖的抑制作用*

    李彬彬1, 黃國(guó)良2, 孔 霞1, 李 蓉1, 董子明3, 何志巍1,2△

    (廣東醫(yī)學(xué)院1病理生理學(xué)教研室,2廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 東莞 523808;3鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,河南 鄭州 450001)

    目的應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1中組蛋白H3的表達(dá),觀察其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響。方法構(gòu)建針對(duì)組蛋白H3的小干擾RNA(siRNA)的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞并篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中組蛋白H3 mRNA和蛋白表達(dá)的改變;CCK-8法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖能力的改變;雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞激活蛋白1(AP-1)轉(zhuǎn)錄活性的改變。結(jié)果與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比,siRNA-H3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的組蛋白H3 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下降,細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢,表皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞克隆形成能力和AP-1轉(zhuǎn)錄活性均受到明顯抑制。結(jié)論通過(guò)RNA干擾技術(shù)阻斷組蛋白H3的表達(dá),可抑制CNE1細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖,其機(jī)制可能與下調(diào)AP-1轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。組蛋白H3 可能是潛在的腫瘤治療新靶點(diǎn)。

    鼻咽腫瘤; 組蛋白H3; RNA干擾; 激活蛋白1

    表觀遺傳(epigenetics)是指DNA序列不發(fā)生變化但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變[1]。通常DNA序列的改變是永久性的,而許多表觀遺傳的改變則是可逆的。表觀遺傳修飾主要包括以下4個(gè)方面:DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)和非編碼RNA的調(diào)控。任何一個(gè)方面的異常都將影響染色體結(jié)構(gòu)和基因表達(dá),導(dǎo)致多種疾病及腫瘤的發(fā)生[2]。組蛋白修飾是細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要信息平臺(tái),它通過(guò)整合上游分子通路,產(chǎn)生適宜的細(xì)胞核信號(hào),如轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制,從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。近年來(lái)大量研究顯示,組蛋白H3異常修飾介導(dǎo)了腫瘤發(fā)生、演進(jìn)的多個(gè)過(guò)程,是腫瘤表觀遺傳學(xué)的重要機(jī)制[2-3]。激活蛋白1 (activator protein-1, AP-1)是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子, 參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化等過(guò)程,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。但對(duì)AP-1轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控機(jī)制目前尚未闡明。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種選擇性沉默基因表達(dá)的有效工具,對(duì)此,我們構(gòu)建了U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的、組蛋白H3基因的小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)表達(dá)質(zhì)粒,降低人鼻咽癌CNE1細(xì)胞中組蛋白H3的表達(dá),并探討其對(duì)CNE1細(xì)胞增殖的影響和機(jī)制。

    材 料 和 方 法

    1材料和主要試劑

    1.1菌株、細(xì)胞和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α和人鼻咽癌CNE1細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存;mU6pro質(zhì)粒由美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)惠贈(zèng);pcDNA3.1質(zhì)粒由廣東醫(yī)學(xué)院張湘寧博士惠贈(zèng);pRTU14 AP-1 reporter vector 由德國(guó)Helmholtz Zentrum München研究中心惠贈(zèng)。

    1.2主要試劑 限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和XbaⅠ均購(gòu)自NEB;T4 DNA連接酶購(gòu)自大連TaKaRa;兔抗人組蛋白H3和H2A多抗購(gòu)自Cell Signaling;紅外標(biāo)記羊抗兔Ⅱ抗購(gòu)自Rockland;JetPEI 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Polyplus;G418和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)購(gòu)自Sigma-Aldrich;Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所;Dual-Luciferase Reporter Assay System 購(gòu)自Promega。

    2方法

    2.1組蛋白H3 siRNA序列的設(shè)計(jì)和合成 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找人類(lèi)組蛋白H3 mRNA的序列(NM_003537),其編碼序列(coding sequence,CDS)為1~411 bp。參考Choi等[6]的研究結(jié)果,選取16~34位(CAGACAGCTCGGAAATCCA)作為靶位點(diǎn)。按照mU6pro質(zhì)粒的結(jié)構(gòu),設(shè)計(jì)包含BbsⅠ和XbaⅠ酶切殘端并能表達(dá)發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA的2條寡核苷酸序列: 正義鏈5’-TTTGCAGACAGCTCGGAAATCCATTCAAGA-GATGGATTTCCGAGCTGTCTGTTTTTT-3’,反義鏈5’-CTAGAAAAAACAGACAGCTCGGAAATCCATCTCTT-GAATGGATTTCCGAGCTGTCTG-3’。同時(shí),設(shè)計(jì)1對(duì)陰性對(duì)照序列,經(jīng)BLAST同源比對(duì),此序列不與任何人類(lèi)基因序列同源。所有序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

    2.2真核表達(dá)質(zhì)粒mU6pro-siRNA-H3的構(gòu)建 建立退火體系:50 μmol/L正反義鏈模板10 μL,5×Annealing Buffer 5 μL,加滅菌ddH2O 至50 μL。在PCR儀上進(jìn)行退火反應(yīng):95 ℃ 2 min,每90 s下降1 ℃,降至25 ℃,-20 ℃保存。BbsⅠ和XbaⅠ雙酶切mU6pro質(zhì)粒,純化后的線性化載體與退火產(chǎn)物連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒mU6pro-siRNA-H3(si-H3)和陰性對(duì)照質(zhì)粒mU6pro-siRNA-mock(si-mock)。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α,用含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基培養(yǎng)并篩選轉(zhuǎn)化子,挑取單個(gè)菌落,在含100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。取培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行菌落PCR法鑒定,上游引物在U6啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì):5’-ATATCCCTTGGAGAAAAGCCCTT-3’,而下游引物則是該質(zhì)粒上M13R2的序列: 5’-CACAGGAAACAGCTATGACCAT-3’。陽(yáng)性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

    2.3基因轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株篩選 CNE1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中,以5×105cells/well接種于6孔板中,培養(yǎng)至70%~80%融合,使用Polyplus 公司的JetPEI 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行si-H3和si-mock質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。因mU6pro質(zhì)粒缺乏抗性篩選標(biāo)記,故與pcDNA3.1質(zhì)粒按10∶1進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后24 h,將細(xì)胞以1∶10的比例傳代至10 cm 培養(yǎng)板皿中,次日加入選擇性抗生素G418 200 mg/L進(jìn)行加壓篩選,構(gòu)建穩(wěn)定干擾組蛋白H3的CNE1細(xì)胞株。

    2.4實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)組蛋白H3 mRNA的表達(dá) Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,按照Roche逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA第1鏈;以cDNA為模板,7500實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。組蛋白H3上游引物5’-GTTGCTGATTCGGAAGCTGC -3’,下游引物5’-GAAGCGAAGATCGGTCTTGAA-3’;GAPDH上游引物5’-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3’,下游引物5’- CCCAATACGACCAAATCCGTT -3’。檢測(cè)各模板的閾值循環(huán)數(shù)(Ct),ΔΔCt=(Ct目的基因-CtGAPDH)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-CtGAPDH)對(duì)照組,以2-ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。

    2.5Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞組蛋白H3的表達(dá) 酸溶性蛋白抽提法提取組蛋白[7]:收集的細(xì)胞用PBS洗2次,加入細(xì)胞裂解液 (10 mmol/L HEPES,pH 7.9,1.5 mmol/L MgC12,10 mmol/L KCl,0.5 mmol/L DTT和1.5 mmol/L PMSF),冰浴1 h;4 ℃、8 000 r/min離心10 min,棄上清,沉淀用0.2 mol/L H2SO4重懸,冰浴30 min;收集上清液,加人5倍體積的冰丙酮,-20 ℃沉淀過(guò)夜;收集沉淀蛋白,用去離子水溶解沉淀,-80 ℃保存。

    取等量樣品,進(jìn)行15%SDS-PAGE,將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h;加入組蛋白H3抗體(1∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜;加入紅外標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶10 000),室溫孵育1 h;Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)掃描成像,組蛋白H2A作為內(nèi)參照,Quantity One軟件進(jìn)行半定量分析。

    2.6CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞體外增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,以1 000 cells/well接種到96孔板,每組設(shè)5個(gè)平行孔并設(shè)不含細(xì)胞的空白對(duì)照,37 ℃連續(xù)培養(yǎng)5 d;每天于同一時(shí)間取出加入CCK-8試劑10 μL/well,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm波長(zhǎng)各孔吸光度(A450)。根據(jù)每組細(xì)胞A450值繪制生長(zhǎng)曲線。

    2.7平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,以300 cells/well接種于含EGF(0 μg/L或10 μg/L)培養(yǎng)基的6孔板中,每組設(shè)3個(gè)平行孔,靜置培養(yǎng)2周;用PBS清洗細(xì)胞2次,甲醇固定15 min后,0.4%結(jié)晶紫染色15 min,流水沖洗;將平皿倒置并疊加1張帶網(wǎng)格的透明膠片,用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆。

    2.8雙螢光素酶報(bào)告基因分析檢測(cè)AP-1轉(zhuǎn)錄活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,以1.0×105cells/well接種到24孔板,每組設(shè)3個(gè)平行孔,次日共轉(zhuǎn)染AP-1-luc 報(bào)告質(zhì)粒和pRL-TK 內(nèi)參照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h后移去培養(yǎng)基,換用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24 h后用30 μg/L EGF刺激3 h,加入100 μL細(xì)胞裂解液,室溫下輕緩晃動(dòng)15 min。收集細(xì)胞裂解液,按Dual-Luciferase Reporter Assay System 說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定螢火蟲(chóng)螢光素酶和海腎螢光素酶的活性,以兩者的比值反映AP-1轉(zhuǎn)錄活性。

    3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS 17.0及GraphPad Prism軟件分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1重組質(zhì)粒si-H3的PCR鑒定和測(cè)序結(jié)果

    重組質(zhì)粒si-H3及其陰性對(duì)照質(zhì)粒si-mock分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑選氨芐青霉素抗性菌液進(jìn)行陽(yáng)性克隆菌液PCR鑒定,陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物大小為385 bp。將陽(yáng)性克隆菌液進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果與所設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列一致, 表明si-H3和si-mock真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    2穩(wěn)定干擾組蛋白H3CNE1細(xì)胞株的構(gòu)建

    將si-H3質(zhì)粒、si-mock質(zhì)粒與pcDNA3.1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞,采用G418加壓篩選獲得穩(wěn)定干擾組蛋白H3的CNE1細(xì)胞株及陰性對(duì)照細(xì)胞株。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(圖1)和Western blotting(圖2)檢測(cè)組蛋白H3 mRNA和蛋白表達(dá)水平。與空白對(duì)照組(blank)相比,陰性對(duì)照組(si-mock)細(xì)胞組蛋白H3的mRNA和蛋白表達(dá)均無(wú)明顯差異。與空白對(duì)照及陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染si-H3質(zhì)粒的CNE1細(xì)胞組蛋白H3的mRNA出現(xiàn)明顯降低,約為陰性對(duì)照組的33.6%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白對(duì)照及陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染si-H3質(zhì)粒的CNE1細(xì)胞組蛋白H3的蛋白表達(dá)水平亦明顯下調(diào),約為陰性對(duì)照組的38.8%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這表明已成功構(gòu)建穩(wěn)定干擾組蛋白H3表達(dá)的CNE1細(xì)胞株。

    3siRNA-H3對(duì)CNE1細(xì)胞增殖的影響

    在細(xì)胞接種后1~5 d,以CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。與空白對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯改變;但與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染si-H3質(zhì)粒的CNE1細(xì)胞在48 h后生長(zhǎng)速度明顯減慢,細(xì)胞群體倍增時(shí)間延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖3。這表明siRNA下調(diào)組蛋白H3的表達(dá)可明顯抑制CNE1細(xì)胞的增殖。

    4siRNA-H3對(duì)CNE1細(xì)胞克隆形成能力的影響

    EGF作為腫瘤促進(jìn)因子,如圖4所示,可以促進(jìn)CNE1細(xì)胞的克隆形成能力,主要引起集落形成大小的增加。在無(wú)或有EGF(10 μg/L)刺激下,與空白對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組細(xì)胞的克隆形成數(shù)目及集落形成大小均無(wú)明顯改變;但與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染si-H3質(zhì)粒的CNE1細(xì)胞的集落形成數(shù)目及集落形成大小均明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖4。表明在有或無(wú)EGF刺激下,下調(diào)組蛋白H3表達(dá)均可有效抑制CNE1細(xì)胞的克隆形成能力。

    Figure 1. The mRNA level of histone H3 in stably transfected cells detected by real-time fluorescence quantitative RT-PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-mock.

    圖1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中組蛋白H3mRNA的表達(dá)

    Figure 2. The expression of histone H3 protein in stably transfected cells detected by Western blotting. Mean±SD.n= 3.*P<0.05vssi-mock.

    圖2Westernblotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中組蛋白H3的表達(dá)

    Figure 3. The effect of histone H3 knockdown on CNE1 cell proliferation. Mean±SD.n=3.*P<0.05.**P<0.01vssi-mock group.

    圖3干擾組蛋白H3表達(dá)對(duì)CNE1細(xì)胞增殖的影響

    Figure 4. The effect of histone H3 knockdown on colony formation of CNE1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vssi-mock.

    圖4干擾組蛋白H3表達(dá)對(duì)CNE1細(xì)胞克隆形成能力的影響

    5siRNA-H3對(duì)CNE1細(xì)胞AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響

    如圖5所示,EGF (30 μg/L) 可以明顯增強(qiáng)CNE1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AP-1的啟動(dòng)子活性,約為對(duì)照組的2.82倍。在無(wú)或有EGF(30 μg/L)刺激下,與陰性對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組細(xì)胞的AP-1的轉(zhuǎn)錄活性均無(wú)明顯改變;但與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染si-H3質(zhì)粒的CNE1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AP-1啟動(dòng)子活性明顯降低,與空白對(duì)照組相比分別下降了約52.8%和73.1%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明在有或無(wú)EGF刺激下,下調(diào)組蛋白H3表達(dá)均可明顯抑制CNE1細(xì)胞的AP-1轉(zhuǎn)錄活性。

    Figure 5. The effect of histone H3 knockdown on AP-1 transcriptional activation in CNE1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vssi-mock.

    圖5干擾組蛋白H3表達(dá)對(duì)CNE1細(xì)胞AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響

    討 論

    核小體是染色質(zhì)的基本單位,核小體的核心由組蛋白H2A、H2B、H3 和H4各2個(gè)分子形成的八聚體和纏繞在上面的DNA分子構(gòu)成。組蛋白在翻譯完成后,其N(xiāo)-末端氨基酸殘基會(huì)發(fā)生乙?;?、磷酸化、甲基化、泛素化、糖基化等共價(jià)修飾,從而提供一種識(shí)別的標(biāo)志,稱(chēng)為組蛋白密碼[8]。組蛋白的這些修飾幾乎都能影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,進(jìn)而改變組蛋白和DNA的相互作用,在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起關(guān)鍵作用。

    大量研究表明[2-3],組蛋白修飾異??梢鹣鄳?yīng)染色體結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄水平的改變,影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。Feil等[9]報(bào)道,不利環(huán)境因素、飲食習(xí)慣等可以在不改變DNA序列的情況下,通過(guò)DNA甲基化和組蛋白共價(jià)修飾來(lái)擾亂相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),從而介導(dǎo)某些腫瘤的發(fā)生。近年來(lái),組蛋白H3修飾異常與腫瘤發(fā)生的關(guān)系取得很大的進(jìn)展。Tzao等[10]發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者中H3 K18乙?;虷3 K27三甲基化水平與腫瘤分化程度呈正相關(guān),H3 K27三甲基化水平低下的患者呈現(xiàn)較好的預(yù)后,提示H3 K27三甲基化水平可作為預(yù)測(cè)食管鱗癌患者預(yù)后的指標(biāo)。H3 Ser10磷酸化是保證染色體濃縮和分離必不可少的因素之一。由AIM-1/Aurora B過(guò)表達(dá)引起的組蛋白H3 Ser10磷酸化水平的增高被發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)多種腫瘤中如結(jié)直腸癌、肝癌[11-12],可促進(jìn)染色體的不穩(wěn)定。我們?cè)谇懊娴难芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)[7],H3 Ser10磷酸化在低分化鼻咽癌組織中的表達(dá)明顯高于鼻咽炎癥組織和癌旁正常組織,并且與EB病毒潛伏性膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。Nishikawa等[13]研究顯示,EB 病毒陽(yáng)性而LMP1呈低表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞TWO3-EBV經(jīng)乙烯基丁酸酯或去乙?;敢种苿﹖richostatin A 處理后,出現(xiàn)LMP1 表達(dá)水平上升,同時(shí),TWO3-EBV細(xì)胞中乙酰化組蛋白H3 和H4 的表達(dá)也持續(xù)上升,顯示組蛋白過(guò)乙酰化能上調(diào)EBV感染鼻咽癌細(xì)胞中的LMP1 的表達(dá)水平。

    近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)組蛋白H3具有“癌基因”效應(yīng)。Choi等[6]發(fā)現(xiàn)在小鼠JB6 C141細(xì)胞中過(guò)表達(dá)組蛋白H3可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化,集落形成能力增強(qiáng),而采用siRNA降低組蛋白H3的表達(dá)則可明顯抑制細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。AP-1屬于一類(lèi)由即刻早期基因家族包括Jun、Fos和激活轉(zhuǎn)錄因子(activating transcription factor,ATF)組成的核轉(zhuǎn)錄因子。多種腫瘤刺激因子如EGF、佛波酯、紫外線以及氧化應(yīng)激等均能誘導(dǎo)AP-1的激活。AP-1被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中呈高表達(dá),通過(guò)調(diào)控下游多個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄活化在細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化以及腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮作用[4-5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)[6,14],組蛋白H3 Ser10磷酸化通過(guò)促進(jìn)即刻早期反應(yīng)基因c-jun、c-fos的轉(zhuǎn)錄激活進(jìn)而調(diào)控AP-1的轉(zhuǎn)錄活性包括轉(zhuǎn)錄激活能力、DNA結(jié)合能力及穩(wěn)定性,在EGF、佛波酯等促進(jìn)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用。

    本研究利用siRNA干擾CNE1細(xì)胞組蛋白H3基因,實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示組蛋白H3表達(dá)在mRNA和蛋白水平均出現(xiàn)了明顯的降低,證明合成的siRNA能有效地沉默組蛋白H3基因,下調(diào)組蛋白H3的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,采用CCK-8 實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE1細(xì)胞增殖能力的改變,結(jié)果顯示siRNA-H3沉默的CNE1細(xì)胞的增殖被顯著抑制,生長(zhǎng)速度明顯減慢,其克隆形成數(shù)目和克隆形成大小均明顯減少。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)顯示與細(xì)胞增殖相關(guān)的AP-1轉(zhuǎn)錄活性被明顯抑制。EGF是一強(qiáng)有力的促細(xì)胞分裂因子,它通過(guò)與EGF受體結(jié)合激活酪氨酸蛋白激酶活化引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化。本研究也發(fā)現(xiàn),EGF可明顯促進(jìn)CNE1細(xì)胞的增殖,并可增強(qiáng)AP-1的轉(zhuǎn)錄活性。但下調(diào)組蛋白H3的表達(dá)可顯著抑制EGF促進(jìn)的細(xì)胞克隆形成能力及AP-1的轉(zhuǎn)錄活性。這些結(jié)果提示組蛋白H3作為正調(diào)控因子介導(dǎo)CNE1細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化,組蛋白H3對(duì)轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性的調(diào)控可能是組蛋白H3介導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制。組蛋白H3有望成為腫瘤化療和基因治療的重要靶點(diǎn)。

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    SmallinterferingRNA-mediatedsilencingofhistoneH3inhibitsproliferationofhumannasopharyngealcarcinomacells

    LI Bin-bin1, HUANG Guo-liang2, KONG Xia1, LI Rong1, DONG Zi-ming3, HE Zhi-wei1,2

    (1DepartmentofPathophysiology,2GuangdongProvincialKeyLaboratoryofMedicalMolecularDiagnostics,GuangdongMedicalCollege,Dongguan523808,China;3DepartmentofPathophysiology,BasicMedicalCollegeofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China.E-mail:zhiweihe688@yahoo.com)

    AIM: To study the effect of histone H3 down-regulation by RNA interference on the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells.METHODSThe small interfering RNA (siRNA) vector targeting histone H3 was constructed and transfected into CNE1 cells, and then stably transfected CNE1 cells were established. The expression of histone H3 mRNA and protein was measured by real-time fluorescence quantitative RT-PCR and Western blotting, respectively. The proliferation ability of CNE1 cells was evaluated by CCK-8 and colony-forming assays. The transcriptional activity of activator protein-1 (AP-1) was examined by dual-luciferase reporter gene assay.RESULTSCompared with negative control and blank control groups, histone H3 mRNA and protein expression was markedly decreased in siRNA-H3 stably transfected CNE1 cells. Knockdown of histone H3 caused a significant inhibition of cell proliferation. Furthermore, the colony formation and AP-1 transcriptional activity promoted by epidermal growth factor were obviously suppressed.CONCLUSIONKnockdown of histone H3 could significantly inhibit the proliferation of CNE1 cells by down-regulating the AP-1 transcriptional activity, and therefore histone H3 might serve as a therapeutic target in cancer treatment.

    Nasopharyngeal neoplasms; Histone H3; RNA interference; Activator protein-1

    R739.6

    A

    1000- 4718(2013)09- 1625- 06

    2013- 06- 07

    2013- 07- 10

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81071638);廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項(xiàng)目(No. A2011424)

    △通迅作者 Tel: 0769-22896324; E-mail: zhiweihe688@yahoo.com

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.015

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