四逆湯對(duì)同型半胱氨酸損傷的EAhy926細(xì)胞caveolin-1和eNOS表達(dá)的影響*

劉 勇， 郝寶順， 劉定輝， 宋志明， 余舒杰， 周 彬， 吳 琳， 王 敏， 朱潔明， 錢孝賢，△， 陳 璘, 吳偉康

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510630； 2中山大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，廣東 廣州 510080)

四逆湯對(duì)同型半胱氨酸損傷的EAhy926細(xì)胞caveolin-1和eNOS表達(dá)的影響*

劉 勇1， 郝寶順1， 劉定輝1， 宋志明1， 余舒杰1， 周 彬1， 吳 琳1， 王 敏1， 朱潔明1， 錢孝賢1，2△， 陳 璘1, 吳偉康2

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510630；2中山大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，廣東 廣州 510080)

目的探討四逆湯(Sini decoction，SND)防治內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制及陷窩蛋白1(caveolin-1)和一氧化氮(NO)系統(tǒng)在其中的作用。方法建立同型半胱氨酸(Hcy)損傷的人臍靜脈內(nèi)皮融合細(xì)胞(EAhy926細(xì)胞)模型，觀察四逆湯的保護(hù)作用及其對(duì)NO系統(tǒng)和caveolin-1的影響。結(jié)果Hcy加入后細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，貼壁細(xì)胞數(shù)明顯減少，NO濃度明顯減低(P<0.05)，caveolin-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)，內(nèi)皮型NO合酶(eNOS) mRNA和蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.05)；四逆湯處理組貼壁細(xì)胞及細(xì)胞形態(tài)明顯改善，NO濃度較Hcy模型組明顯升高(P<0.05)，caveolin-1 mRNA和蛋白表達(dá)較Hcy模型組明顯減弱(P<0.05)，eNOS mRNA和蛋白表達(dá)較Hcy模型組明顯增強(qiáng)(P<0.05)，其中以四逆湯1.0 kg/L +Hcy 4.0 μmol/L組最明顯。結(jié)論Hcy可能通過增加caveolin-1表達(dá)和抑制eNOS表達(dá)而損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，而四逆湯通過抑制caveolin-1表達(dá)和增加eNOS的表達(dá)拮抗Hcy對(duì)細(xì)胞的損傷。

四逆湯; 內(nèi)皮細(xì)胞; 陷窩蛋白1; 內(nèi)皮型一氧化氮合酶

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是威脅人類健康的重要疾病，各種原因如增齡、高血糖和高血壓都可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，最終導(dǎo)致各種老年性疾病如冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生[1]。因此，內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的重要病理生理機(jī)制，如果能對(duì)此進(jìn)行深入研究，尋找針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的干預(yù)方法，將延緩動(dòng)脈粥樣硬化等年齡相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展，延長(zhǎng)人們的壽命。前期研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮(nitric oxide,NO)系統(tǒng)和陷窩蛋白1(caveolin-1)參與了內(nèi)皮細(xì)胞損傷的發(fā)病機(jī)制，而目前臨床采用四逆湯(Sini decoction，SND)治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化產(chǎn)生了很好的療效[1]，獲得一定程度的認(rèn)可。四逆湯由附子、干姜、甘草三味藥物組成，基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)四逆湯對(duì)一氧化氮系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用。本研究旨在探討四逆湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的可能機(jī)制及caveolin-1和一氧化氮系統(tǒng)在其中的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮融合細(xì)胞(EAhy926細(xì)胞)，購(gòu)自上海生物研究所。

1.2藥物和儀器 四逆湯：附子60 g、干姜36 g、甘草24 g(購(gòu)自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥劑科)，加雙蒸水500 mL，浸泡30 min，水煮沸騰后改小火煎煮30 min，取上清液以12 000 r/min離心20 min，取上清以0.22 μm濾器除菌后分裝，-20 ℃保存；同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)購(gòu)自Sigma；NO試劑盒購(gòu)自南京建成公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)試劑：Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTMKit購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。熒光定量PCR儀：Applied Biology 7500；Western blotting全套儀器購(gòu)自天能公司。

2方法

2.1Hcy損傷模型的建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的EAhy926細(xì)胞按每孔1×104接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～60%時(shí)，換用含不同濃度同型半胱氨酸(0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后分別提取上清液、蛋白和RNA。

2.2四逆湯對(duì)Hcy損傷細(xì)胞的保護(hù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的EAhy926細(xì)胞按每孔1×104接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～60%時(shí)，換用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞8 h，加入含不同濃度四逆湯(0、1.0、0、0.5和1.0 kg/L)的DMEM培養(yǎng)基作用1 h，1 h后各組換用含同型半胱氨酸4.0 μmol/L培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后分別提取上清液、蛋白和RNA。

2.3細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO檢測(cè) 采用硝酸還原酶法，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和caveolin-1 mRNA表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

2.4.1細(xì)胞總RNA提取 總mRNA提取步驟按Trizol說明書進(jìn)行，細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入1 mL Trizol以裂解細(xì)胞，吸入無酶EP管中，每管加入0.2 mL氯仿，用手劇烈振搖后室溫靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上層水相至新的無酶EP管中，每管加入400 μL異丙醇混勻，室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，每管加入1 mL 75%乙醇(99.9%乙醇∶DEPC水=3∶1)洗滌RNA沉淀；4 ℃、7 500 r/min離心5 min；棄上清，紙巾吸盡殘留液，室溫干燥7 min；每管加入DEPC水30 μL溶解RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT regent Kit說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?37 ℃15 min(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))、85 ℃ 5 s(逆轉(zhuǎn)錄的失活反應(yīng))。

2.4.3Real-time PCR (1)引物如下：eNOS(GenBank No.NM_001165413)前向引物5’-TGG TAC ATG AGC ACT GAG ATC G-3’，逆向引物5’-CCA CGT TGA TTT CCA CTG CTG-3’；caveolin-1前向引物5’-CCT CCT CAC AGT TTT CAT CC-3’，逆向引物5’-CAA TCA CAT CTT CAA AGT CAA TC-3’；β-actin(GenBank No.NM-001101.3)前向引物5’-AGC GGG AAA TCG TGC GTG AC-3’，逆向引物5’-TCC ATG CCC AGG AAG GAA GG-3’。(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)按照熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMKit說明書，在ABI7500 PCR儀進(jìn)行，程序如下：預(yù)變性，95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)，先95 ℃ 5 s，后60 ℃ 31 s；(3)用β-actin校準(zhǔn)不同組別eNOS和caveolin-1的表達(dá)，用2-[Ct(eNOS/caveolin-1)-Ct(β-actin)]表示。

2.5Western blotting檢測(cè)eNOS和caveolin-1蛋白表達(dá)

2.5.1蛋白提取 預(yù)先配好蛋白提取液，按南京凱基生物有限公司全蛋白提取試劑盒說明書操作，每700 μL A試劑加入0.7 μL B試劑和0.7 μL C試劑，用PBS清洗細(xì)胞2次，分別用大、小槍頭吸盡PBS液，共吸2次，按照培養(yǎng)孔底面積的大小加入不同體積蛋白提取液，冰上裂解數(shù)分鐘，以細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞，將細(xì)胞提取液吸至預(yù)先標(biāo)記的預(yù)冷EP管，冰上以搖床混勻裂解15 min； 4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；小心吸取上清至新的EP管，為蛋白提取液，以BCA法測(cè)定蛋白濃度，分裝保存于-80 ℃冰箱。

2.5.2Western blotting 各泳道蛋白上樣總量為20 μg，樣品蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上，放入5%脫脂奶粉封閉液室溫?fù)u床上封閉1 h，加Ⅰ抗，放入4 ℃冰箱搖床上過夜，第2天棄去Ⅰ抗，用TBST緩沖液(Tris 50 mmol/L，NaCl 100 mmol/L，pH 7.5，含1%Tween 20)搖床上清洗，加封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫?fù)u床上孵育1 h，棄去Ⅱ抗，1×TBST搖床上清洗PVDF膜3次，加入發(fā)光液，薄膜覆蓋，放膠片曝光，膠片放入顯影液顯影，再放入定影液定影，洗凈膠片，晾干，掃描儀掃描膠片，Quantity One 軟件分析蛋白條帶。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0分析軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1EAhy926細(xì)胞鑒定

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD31，結(jié)果顯示EAhy926細(xì)胞的 CD31表達(dá)率>99.6%，符合內(nèi)皮細(xì)胞特性，見圖1。

Figure 1. Detection of CD31 on the surface of the cells by flow cytometry to identify endothelial cells.

圖1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD31鑒定內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)果

2Hcy對(duì)EAhy926細(xì)胞的損傷作用

EAhy926細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～60%時(shí)，換用含不同濃度同型半胱氨酸的培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 μmol/L Hcy培養(yǎng)基加入后細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，且隨濃度增加，貼壁細(xì)胞數(shù)明顯減少，其中以4.0 μmol/L Hcy作用24 h對(duì)總體細(xì)胞數(shù)影響較小且能有效誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，故作為Hcy損傷模型，見圖2。

Figure 2. Representative morphology of EAhy926 cells after treatment with various concentrations of Hcy for 24 h(×10).

圖2不同濃度Hcy培養(yǎng)24h后EAhy926細(xì)胞形態(tài)

3四逆湯對(duì)Hcy損傷EAhy926細(xì)胞的保護(hù)作用

EAhy926細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～60%時(shí)，經(jīng)不同濃度四逆湯(0、1.0、0、0.5和1.0 kg/L)預(yù)處理后，換用含同型半胱氨酸4.0 μmol/L培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，Hcy模型組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，貼壁細(xì)胞數(shù)明顯減少；四逆湯組與模型組相比，貼壁細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞形態(tài)明顯改善，其中以四逆湯1.0 kg/L+Hcy 4.0 μmol/L組最明顯，見圖3。

4Hcy對(duì)EAhy926細(xì)胞NO水平的影響

隨著Hcy濃度增加，EAhy926細(xì)胞培養(yǎng)液上清NO濃度逐漸減少，且以Hcy 8.0 μmol/L最顯著，見圖4。

Figure 3. Effect of Sini decoction(SND) on EAhy926 cells injured by Hcy (×10).

圖3四逆湯對(duì)Hcy損傷EAhy926細(xì)胞的保護(hù)作用

Figure 4. Effects of Hcy on NO concentration in the supernatant of EAhy926 cells.Mean±SD.n=3.#P<0.05vs0 μmol/L.

圖4Hcy對(duì)EAhy926細(xì)胞NO水平的影響

5四逆湯對(duì)Hcy損傷后EAhy926細(xì)胞NO的影響

四逆湯1.0 kg/L組與對(duì)照組相比，EAhy926細(xì)胞培養(yǎng)液上清NO水平無明顯改變，而Hcy模型組NO水平明顯降低，四逆湯處理組細(xì)胞的NO水平較模型組升高，其中以四逆湯1.0 kg/L+Hcy 4.0 μmol/L組最明顯(P<0.05)，見圖5。

Figure 5. Effects of Sini decoction(SND)on NO concentration in the supernatant of EAhy926 cells injured by Hcy.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSND 0 kg/L+Hcy 0 μmol/L;#P<0.05vsSND 0 kg/L+Hcy 4.0 μmol/L.

圖5四逆湯對(duì)Hcy損傷后EAhy926細(xì)胞NO水平的影響

6四逆湯對(duì)Hcy損傷后eNOS和caveolin-1mRNA表達(dá)的影響

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，四逆湯1.0 kg/L組與對(duì)照組相比，caveolin-1和 eNOS mRNA表達(dá)無明顯改變，而Hcy模型組caveolin-1 mRNA表達(dá)明顯增加，eNOS mRNA表達(dá)明顯減少；與模型組對(duì)比，四逆湯處理組細(xì)胞的caveolin-1 mRNA表達(dá)減少，eNOS mRNA表達(dá)增加，其中以四逆湯1.0 kg/L+Hcy 4.0 μmol/L組最明顯(P<0.05)，見圖6、7。

Figure 6. Effects of Sini decoction(SND) on eNOS mRNA expression in EAhy926 cells injured by Hcy. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSND 0 kg/L+Hcy 0 μmol/L;#P<0.05vsSND 0 kg/L+Hcy 4.0 μmol/L.

圖6四逆湯對(duì)Hcy損傷后eNOSmRNA表達(dá)的影響

7四逆湯對(duì)Hcy損傷后eNOS和caveolin-1蛋白表達(dá)的影響

Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，四逆湯1.0 kg/L組與對(duì)照組相比，caveolin-1和 eNOS 蛋白表達(dá)無明顯改變，而Hcy模型組caveolin-1 蛋白表達(dá)明顯增加，eNOS蛋白表達(dá)明顯減少；與Hcy模型組對(duì)比，四逆湯處理組細(xì)胞的caveolin-1 蛋白表達(dá)減少，eNOS mRNA表達(dá)增加，其中以四逆湯1.0 kg/L+Hcy 4.0 μmol/L組最明顯,見圖8、9。

Figure 7. Effects of Sini decoction(SND) on caveolin-1 mRNA expression in EAhy926 cells injured by Hcy. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSND 0 kg/L+Hcy 0 μmol/L;#P<0.05vsSND 0 kg/L+Hcy 4.0 μmol/L.

圖7四逆湯對(duì)Hcy損傷后caveolin-1mRNA表達(dá)的影響

Figure 8. Effects of Sini decoction(SND)on eNOS protein expression in EAhy926 cells injured by Hcy.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSND 0 kg/L+Hcy 0 μmol/L；#P<0.05vsSND 0 kg/L+Hcy 4.0 μmol/L.

圖8四逆湯對(duì)Hcy損傷后eNOS蛋白表達(dá)的影響

討 論

本實(shí)驗(yàn)采用中藥煎劑過濾除菌后加入完全培養(yǎng)基作用于細(xì)胞,一次性完成藥物的制備，從而保證了藥物作用劑量的穩(wěn)定，而通過煎煮的方法制備藥物，繼承了經(jīng)典的中藥湯劑傳統(tǒng)，保證了藥物有效成份的含量。通過高速離心去除粗顆粒樣雜質(zhì)，再經(jīng)過濾器過濾除菌，保證了藥物的純凈。經(jīng)上述方法制備的四逆湯加入完全培養(yǎng)基后成功作用于細(xì)胞，而且與對(duì)照組比較，單純四逆湯對(duì)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)無明顯影響，證明中藥煎劑經(jīng)過離心及過濾可成功應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Hcy損傷組EAhy926細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，且隨濃度增加，貼壁細(xì)胞數(shù)明顯減少，四逆湯組與Hcy損傷組相比，貼壁細(xì)胞明顯增加，細(xì)胞形態(tài)明顯改善，結(jié)果顯示四逆湯有明確的減輕Hcy對(duì)EAhy926細(xì)胞損傷的作用。

Figure 9. Effects of Sini decoction(SND) on caveolin-1 protein expression in EAhy926 cells injured by Hcy.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSND 0 kg/L+Hcy 0 μmol/L;#P<0.05vsSND 0 kg/L+Hcy 4.0 μmol/L.

圖9四逆湯對(duì)Hcy損傷后caveolin-1蛋白表達(dá)的影響

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是血管壁慢性炎癥的一個(gè)結(jié)果。其中一個(gè)主要事件是中性粒細(xì)胞的聚集和血小板對(duì)斑塊之上內(nèi)皮的黏附。NO是血管內(nèi)平衡的一個(gè)重要生理調(diào)節(jié)因子，牽涉到動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理過程。NO由NOS產(chǎn)生，NOS包括3種亞型，在粥樣硬化斑塊3種亞型均有表達(dá)，3種亞型在催化活動(dòng)、基因調(diào)節(jié)和細(xì)胞腔隙不同。在正常動(dòng)脈eNOS是主要的亞型，eNOS是結(jié)構(gòu)型酶，產(chǎn)生低濃度NO，NO是血小板活化、聚集的潛在調(diào)節(jié)因子，而多種證據(jù)顯示血小板促進(jìn)動(dòng)脈硬化[2]，從某種意義上來說，AS是NO產(chǎn)生不足所致[3]。

動(dòng)脈粥樣硬化是一種血管壁的疾病，其特征是以膽固醇積聚為初始損害，接著是巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的積聚。與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展有關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均表達(dá)caveolae和caveolin-1。Caveolae是一種形成細(xì)胞膜燒瓶樣內(nèi)陷的特殊脂肪筏，caveolin-1是caveolae的主要蛋白成分，是一種具有獨(dú)特構(gòu)象的178個(gè)氨基酸的胞漿膜蛋白，具有肝素樣結(jié)構(gòu)，N端和C端均在細(xì)胞漿，中心區(qū)域在胞漿膜。大量研究顯示caveolin-1在多種類型細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等均可調(diào)節(jié)信號(hào)途徑。用caveolin-1缺失小鼠進(jìn)行的研究顯示完全的caveolin-1缺失與主要的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展減少有關(guān)[4]，而且，幾種可能的致動(dòng)脈粥樣硬化蛋白共同集中于內(nèi)皮細(xì)胞的caveolae，其中一些蛋白涉及脂質(zhì)代謝、細(xì)胞增生和遷移、炎癥或各種信號(hào)途經(jīng)的調(diào)節(jié)[5]。目前研究認(rèn)為內(nèi)皮的caveolin-1可能作為一種促動(dòng)脈粥樣硬化蛋白[6]。Caveolae 和caveolin-1在內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞均有表達(dá)，而這些細(xì)胞均參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展，caveolin-1可發(fā)揮eNOS負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的作用[7]，研究顯示在靜息狀態(tài)下，caveolin-1通過其結(jié)構(gòu)域與eNOS結(jié)合為eNOS-caveolin-1復(fù)合物，這種結(jié)合可以干擾eNOS的還原酶活性基團(tuán)和氧化酶活性基團(tuán)之間的電子傳遞而抑制NO的合成。當(dāng)鈣調(diào)蛋白與Ca2+結(jié)合時(shí)，caveolin-1則從eNOS-caveolin-1復(fù)合物置換出來，形成eNOS-Ca2+復(fù)合物，這種狀態(tài)下eNOS表現(xiàn)為酶活性形式，因而NO生成增加[8]。總之，各種資料顯示caveolae 和caveolin-1可能在內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中起重要作用。

四逆湯是中藥經(jīng)典名方，源于《傷寒論》，原方用于治療少陰病，能溫散里寒及治療陽氣虛衰，陰寒內(nèi)盛的四肢厥逆，用于治療神疲倦怠、冷汗自出、下利清谷、口淡不渴、舌淡苔白、脈沉微或遲弱及誤汗或大汗淋漓之亡陽癥，或真寒假熱、手足厥冷等癥。現(xiàn)代大量動(dòng)物和藥理實(shí)驗(yàn)顯示四逆湯具有多種作用：(1)抗實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化作用：四逆湯可明顯減小主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)斑塊面積，降低血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、載脂蛋白B及血漿內(nèi)皮素和MDA濃度，提高血清NO水平、載脂蛋白A含量與血漿超氧化物歧化酶活性，且四逆湯高劑量組效果最好[9]； (2)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能：四逆湯可明顯降低血漿ET濃度，提高血清NO含量，從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[10-11]；(3)改善冠狀動(dòng)脈循環(huán)：四逆湯可有效降低血液黏度，改善冠狀動(dòng)脈循環(huán)，保護(hù)缺血心肌[11]；(4)抗氧化應(yīng)激作用：四逆湯具有降低心肌氧自由基濃度、升高心肌超氧化物歧化酶活性、降低心肌丙二醛濃度的作用，對(duì)應(yīng)激老年小鼠心臟具有顯著保護(hù)作用[12]。

四逆湯由附子、干姜和甘草3味藥組成，我們?cè)缦鹊难芯孔C明，四逆湯具有抗氧化損傷及調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用,調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能是四逆湯防治冠心病的可能機(jī)制，提示四逆湯具有較好的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[13-15]。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了四逆湯具有抗Hcy損傷作用，觀察到四逆湯升高細(xì)胞外液NO,增加細(xì)胞eNOS的表達(dá)，減低caveolin-1的表達(dá)，顯示四逆湯抗動(dòng)脈硬化的機(jī)制可能與抑制caveolin-1的表達(dá)進(jìn)而增加NO系統(tǒng)的功能有關(guān)。

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EffectofSinidecoctiononexpressionofcaveolin-1andeNOSinEAhy926cellsinjuredbyhomocysteine

LIU Yong1, HAO Bao-shun1, LIU Ding-hui1, SONG Zhi-ming1, YU Shu-jie1, ZHOU Bin1, WU Lin1, WANG Min1, ZHU Jie-ming1, QIAN Xiao-xian1,2, CHEN Lin1, WU Wei-kang2

(1DepartmentofCardiology,theThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2InstituteforIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:xiao-xianq@tom.com)

AIM: To investigate the mechanism of Sini decoction in treating human vascular endothelial cell injury and the roles of caveolin-1 and nitric oxide (NO) system in this procedure.METHODSModel of human umbilical vein endothelial EAhy926 cells injured by homocysteine (Hcy) was established. The protective effect of Sini decoction on the injured EAhy926 cells was observed, and the expression of caveolin-1 and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) was detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting.RESULTSCompared with control group, the Hcy-treated EAhy926 cells showed reduced adherent cell number and NO concentration in culture supernatant, decreased expression of eNOS mRNA and protein, and increased expression of caveolin-1 mRNA and protein (allP<0.05). Compared with Hcy group, better growth of adherent cells, elevated NO concentration in culture supernatant, attenuated expression of caveolin-1 mRNA and protein, and enhanced expression of eNOS mRNA and protein in Sini decoction groups were observed (allP<0.05).CONCLUSIONHomocysteine may injure EAhy926 cells by enhancing the expression of caveolin-1 and suppressing the expression of eNOS, while Sini decoction may protect EAhy926 cells by suppressing the expression of caveolin-1 and enhancing the expression of eNOS.

Sini decoction; Endothelial cells; Caveolin-1; Endothelial nitric oxide synthase

R363.2+1

A

1000- 4718(2013)09- 1579- 06

2013- 06- 13

2013- 08- 16

廣東省科技計(jì)劃(No.2010B080701042)

△通訊作者Tel： 020-85252168； E-mail： xiaoxianq@tom.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.007