振動刺激對SMDA大鼠肌肉中Myf-5含量的影響

林宇峰,李延亭,何建偉

振動刺激對SMDA大鼠肌肉中Myf-5含量的影響

林宇峰1,李延亭2,何建偉3

(1.龍巖學院,福建龍巖364012;2.哈爾濱工業(yè)大學體育部,黑龍江哈爾濱150001;3.莆田學院體育系,福建莆田351100)

目的:探討振動刺激對大鼠腓腸肌中Myf-5含量的影響,進而說明振動刺激對廢用性萎縮肌肉產生的作用。方法:將40只SD雌性大鼠隨機分為正常對照A組、低頻振動B組、高頻振動C組、懸吊D組、自然恢復E組,共5組。除A組外其他4組同時懸吊14天后,取A、D、E3組大鼠的腓腸肌肌肉組織,對B、C兩組分別進行低頻、高頻振動刺激2周后,再取其大鼠腓腸肌肌肉組織,采用Western Blotting印跡法對各組的Myf-5進行定量分析并進行比較。結果:D組Myf-5表達明顯下降(P＜0.05),B、C兩組Myf-5表達顯著增加(P＜0.05)。結論:20Hz和30Hz的振動刺激干預可以有效提高肌肉Myf-5表達水平;低頻振動干預(20Hz)較高頻振動干預(30Hz)的振動刺激對SMDA骨骼肌效果更明顯。

廢用性肌萎縮;振動刺激;Myf-5;基因表達

骨骼肌在較強機械力作用下能夠表現(xiàn)出相應的肥大,具有快速適應外界環(huán)境變化的特點,然而在制動、固定、運動量減退及肌肉失重的狀態(tài)下,則可誘使骨骼肌出現(xiàn)功能性減退,從而導致肌肉廢用性萎縮(Skeletal Muscle Disuse Atrophy),即 SMDA。

目前,在廢用性肌萎縮的防治措施方面,國內外學者們進行了多種途徑的探索。廢用性肌萎縮發(fā)生后,用到的康復方法有:電刺激、肢體牽拉、運動訓練以及振動刺激等。傳統(tǒng)康復方法有外界刺激、主動運動和被動運動療法,如電刺激、機械牽拉刺激、傳統(tǒng)的中醫(yī)針灸火罐治療等;藥物療法,如激素類、受體激動劑、中醫(yī)中藥類等;振動刺激作為一種外源性刺激,可以刺激骨骼肌內部的初級肌梭本體感受器,特別是初級肌梭傳入纖維末梢的興奮性,導致神經發(fā)放沖動強度增大、頻率加快、以及內耳前庭機械感受器和神經中樞機制發(fā)生變化,通過多突觸傳導的調節(jié)作用,使快、慢肌發(fā)放沖動的頻率盡量接近一致,提高運動神經元發(fā)放沖動的同步性。前期研究結果表明振動刺激對于萎縮肌肉的形態(tài)學恢復有著明顯效果。振動刺激對于肌力、本體感覺能力的增強均有一定的積極作用。因此,本研究將其應用于廢用性肌萎縮的康復干預過程中,從分子生物學角度進行實驗研究,考察振動刺激對萎縮肌細胞的蛋白基因表達的影響。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選用8周齡40只健康、無呼吸道感染、無運動障礙及無皮膚病的成年Sprague-Dawley品系雌性大鼠(選擇雌性大鼠是為了避免雄性大鼠尾部懸吊時,由于睪丸供血障礙或睪丸回縮入腹腔影響雄激素分泌水平,進而影響骨骼肌的合成代謝)。體重(240±10.3)g,所有大鼠采用8只/籠喂養(yǎng),懸吊訓練時1只/籠,室溫維持在21℃～24℃;人工智能控制動物房室內照明,每晝夜保持12h黑暗與照明交替循環(huán),并保證能自由進食和飲水。動物適應性飼養(yǎng)14天后,按隨機分配原則分為5組,每組8只。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗對象分組 動物適應性飼養(yǎng)后,隨機分為5組:正常對照A組,低頻振動B組,高頻振動C組,懸吊D組,自然恢復E組,每組8只,具體分組情況見表1。

表1 對不同組別大鼠的實驗設計

1.2.2 實驗對象模型建立與訓練方法 失重大鼠SMDA模型采用尾部懸吊模擬方法進行:該模型設置方法為實驗大鼠身體長軸與水平面呈30°、后肢懸空、前肢著地、尾部懸吊,懸吊同時動物在籠內可以自由飲水、活動、進食;尾部懸吊訓練滿14天后,解除每組大鼠懸吊開始進行各種頻率的振動刺激訓練。本實驗設計使用了固定軟瓶以確保在振動期間大鼠雙側下肢保持直立狀態(tài),振動訓練過程大鼠能夠保持站立在振動臺上,頭可伸直,保持自由,身體直立,不影響正常呼吸;本實驗選擇20Hz作為振動訓練的低頻頻率,振動負荷為10min/次,振幅設定為3mm;次間歇時間為5min,2次/天,5次/周×2周。高頻組使用方法、設備同上,但以30Hz作為振動訓練的頻率,自然恢復組尾部懸吊2周后,自然恢復2周,不做任何外加恢復手段。

1.2.3 腓腸肌肌纖維標本制備 本實驗以大鼠腓腸肌(Gastrocnemius GAS)為代表來觀察和研究廢用性肌萎縮的發(fā)生和變化。各組實驗大鼠以戊巴比妥鈉腹腔麻醉(45mg/kg),腹腔注射后迅速解剖取出大鼠雙側腓腸肌以100g體重標準化,稱其濕重所得數(shù)據(jù)作為腓腸肌肌濕重體重比;應用肌纖維mATPase染色法鑒定肌纖維類型,觀察視野內肌纖維的mATP酶活性,作定性描述。切片厚度為10μm;采用圖像分析系統(tǒng)對各組大鼠的每一腓腸肌肌組織各隨機抽取1張接近肌腹中部的切片,并對各型肌纖維的細胞數(shù)進行定量分析,切片在400倍光鏡下隨機對10個視野進行觀察,計算出每個視野內各型肌纖維數(shù),并計算各型肌纖維的構成比,得大鼠肌纖維數(shù)的均值。

1.2.4 Myf-5蛋白含量測試方法及過程 本實驗采用western blotting印跡法對所測定Myf-5蛋白進行定量分析。先將蛋白通過SDS-PAGE電泳分離開來,利用抗原抗體的免疫反應,再利用電場力的作用將膠上的蛋白轉移到固相載體(NC膜)上,然后再加抗體形成抗原抗體復合物,利用發(fā)光或顯色原理將結果顯示到膜或底片上,用灰度分析出每組結果的均值。

1.2.5 數(shù)理統(tǒng)計法 使用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)記錄和歸檔整理,采用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One Way ANOVA),所有實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標準差(M士S)表示,P＜0.05為顯著性水平,P＜0.01為非常顯著性水平,各組間采用Pearson法作相關分析。

2 實驗結果

2.1 SMDA大鼠動物肌纖維數(shù)量的變化、比較

經過2周懸吊訓練之后,各組大鼠Ⅰ、Ⅱ型肌纖維數(shù)量實驗數(shù)據(jù)見表2,大鼠腓腸肌肌纖維構成比即有明顯改變,Ⅰ型肌纖維的構成比減少,Ⅱ型肌纖維的構成比增加;自然恢復組和振動刺激組肌纖維類型都有從快肌向慢肌轉化的趨勢。其中,低頻恢復組Ⅰ型肌纖維恢復較多,與對照組相比有非常明顯差異(P＜0.01);而高頻恢復組Ⅰ型肌纖維恢復較少,未達到對照組水平,自然恢復E組與A組則沒有選擇性差異;尾部懸吊14d后,B、C組與D組相比,在Ⅰ型肌纖維構成上B組有非常明顯差異(P＜0.01),而C組有顯著性差異(P＜0.05);在Ⅱ型肌纖維B組與D組相比都有著非常明顯差異(P＜0.01),而C組沒有顯著性差異;在總數(shù)上,低頻恢復B組與A組對照組有非常明顯差異(P＜0.01),而高頻恢復組C組與A組對照組則沒有明顯差異,并且在總數(shù)上B組有著明顯的增長趨勢,C組則沒有明顯變化。

表2 Ⅰ、Ⅱ型肌纖維數(shù)量比較

2.2 各組Myf-5蛋白表達的變化

在本實驗中,各組大鼠經過14天懸吊訓練之后,MyoF-5含量的western blotting蛋白表達印跡見圖1,懸吊組D組與A組相比蛋白表達很低,預示著懸吊訓練之后蛋白表達明顯下降,而B、C兩組與對照組A組相比有著明顯增大的趨勢變化,與自然恢復組E組相比也有著顯著性差異,趨勢一樣,并且B組比C組的趨勢更加明顯,B組有非常明顯差異(P＜0.01),C組則有明顯差異(P＜0.05),見圖1、表3。

圖1 MyoF-5 western blotting蛋白表達印跡

各組大鼠MyoF-5蛋白表達水平實驗數(shù)據(jù)的變化趨勢見表3。

表3 各組大鼠MyoF-5蛋白表達水平比較

3 討論與分析

生肌調節(jié)因子(MRFs,又稱為成肌因子)由 MyoD、MyoG、Myf-5、MRF4等4個家族成員組成,具有極其相似的結構特征。Myf-5的氨基酸序列特征是一個緊鄰的B-螺旋-環(huán)-螺旋結構(HLH)和一個含有賴氨酸、精氨酸的堿性區(qū),堿性區(qū)是與螺旋DNA相結合。其是由一個70個殘基組成的同源片段,該區(qū)的另外四個氨基酸(Thr115,ArgⅢ,Lys124,Ala114)是激活肌肉基因轉錄的關鍵因子[1]。Myf-5對骨骼肌發(fā)生起重要的調節(jié)作用,可激活肌肉的基因轉錄,抑制細胞生長周期,促進細胞分化。成肌調節(jié)因子的4個成員在骨骼肌發(fā)育過程中具有時空表達規(guī)律,其中MyoD與Myf-5主要在肌肉前體細胞分化為成肌細胞過程中起作用,而Myogenin與MRF4主要在成肌細胞向終末骨骼肌肌纖維分化過程中起作用[2]。

3.1 Myf-5的作用

過去大量研究已經發(fā)現(xiàn),生肌調節(jié)因子具有調節(jié)肌肉蛋白表達的作用,生肌調節(jié)因子對于肌肉表達的調控點在于能夠很快激活肌肉特異基因的雙向轉錄。MRFs所包含的四個成員都有同源性的bHLH(堿性-螺旋-環(huán)-螺旋)調節(jié)序列,其中HLH是二聚體形成區(qū),堿性區(qū)是結合DNA轉錄區(qū);首先對于含E盒的肌肉特異基因,Myf-5成員與E47和E12結合形成異二聚體,形成異寡聚物復合體,再結合到DNA序列CANNTG(E盒)上;Myf-5對于缺乏E盒的肌肉基因,必需通過激活MEF-2中間因子,轉錄激活這些肌肉基因的表達,促使其與肌肉特異基因的啟動因子相結合[3];此外,Myf-5在成肌細胞分化和增殖過程中扮演重要的角色,可能預示著這些轉錄因子參與肌纖維生長而引起衛(wèi)星細胞的分化和激活,衛(wèi)星細胞的分化、融合、增殖是損傷后修復、持續(xù)負荷引發(fā)肌纖維肥大所不可替代的,所以Myf-5可能參與調節(jié)肌纖維的生長。前期研究還認為,信號鏈中第一個信使是各種激素、轉錄因子和其他調節(jié)蛋白被激活,從而通過這些蛋白調節(jié)基因表達來定量、定性地改變肌肉纖維比例的構成,進而推斷出Myf-5調節(jié)蛋白的機理機制[4]。

3.2 振動刺激對Myf-5在骨骼肌纖維生成表達含量的影響

大量研究表明,廢用狀態(tài)下肌肉蛋白下降的主要原因是蛋白質合成率降低而分解率增加,因而導致機體肌肉蛋白質總量的減少,這是導致骨骼肌廢用性萎縮可能的直接原因,生肌調節(jié)因子Myf-5是與骨骼肌的生成有重要關系的因子[5]。振動刺激作為一種新的力量訓練方法,對肌肉做功能力和力量的提升有長期持續(xù)和快速形成的良好作用,振動刺激強度采用不同的試驗頻率,可能得到不同的效果[6]。

根據(jù)表2和圖1可知,D組Myf-5表達水平明顯下降。D組與其余4組相比差異顯著(P＜0.05),B組和C組Myf-5蛋白表達水平明顯上升,其中B組與A組間差異非常顯著(P＜0.01),B組與C組之間差異顯著(P＜0.05),C組與A組間有顯著性差異(P＜0.05)。表明自然恢復組(E)和振動刺激組(B、C)跟懸吊組(D)相比,myogenin都有從低到高恢復的趨勢。并且其中的低頻刺激組(B)比高頻刺激組(C)的myogenin增加得較多,已經明顯超過正常對照組,而低頻刺激組增加得相對較少。自然恢復組(E)未達到正常對照組水平。懸吊組(D)最低,較正常對照組(A)明顯下降。因此,該實驗的研究結果支持預期的研究假設,說明振動刺激對于提高廢用性肌萎縮的康復訓練效果有積極作用。

3.3 振動刺激對Myf-5在骨骼肌中蛋白表達含量的影響

肌肉萎縮、廢用狀態(tài)下骨骼肌內部最明顯的變化就是蛋白表達的減少,表現(xiàn)為Myf-5表達的急劇減少,前人研究已經從肌肉濕重、肌纖維橫截面積以及肌纖維類型的改變等形態(tài)學方面證實了振動刺激對抗廢用性肌萎縮是安全可靠且有效的[7,8]。Myf-5是骨骼肌細胞增殖、分化的正性調控因子,對骨骼肌再生、轉型、生長中起著非常重要作用[9]。依據(jù)表3實驗結果可以看出,懸吊14天后,D組Myf-5蛋白表達水平明顯下降,較正常對照組下降了15.57%,并且D組與另外4組相比差異都很顯著,說明懸吊引起的腓腸肌肌萎縮和Myf-5表達減少有重要關系,也許正是因為Myf-5表達水平的下降,導致肌蛋白合成速度減慢、合成率減少,于是造成了骨骼肌的萎縮;與之相反,給予不同頻率的振動刺激之后,B、C組Myf-5表達水平明顯上升,B、C組較正常對照A組分別上升了22.54%、9.19%,說明給予不同頻率的振動刺激均可促使Myf-5蛋白表達水平升高,加速骨骼肌萎縮的恢復過程,其中B組較正常對照A組有非常顯著性差異(P＜0.01),B組與C組差異不大,C組與正常對照A組間有顯著性差異(P＜0.05)。說明較低頻率的20Hz振動刺激較較高頻率30Hz會更加快速提升骨骼肌中Myf-5蛋白的表達水平,促進肌蛋白合成,而自然恢復E組Myf-5的蛋白表達較D組則沒有明顯升高、變化,與正常對照A組相比仍然有顯著差異(P＜0.05)。

總結大量研究文獻說明在骨骼肌萎縮、廢用時,早期便會出現(xiàn)與蛋白合成相關的分子表達改變,即萎縮、廢用狀態(tài)下骨骼肌蛋白質代謝的主要表現(xiàn)為:蛋白表達能力下降,蛋白質合成率降低,而分解率增加[10-11]。本研究表明振動刺激能夠有效對抗來自懸吊導致的大鼠腓腸肌廢用性萎縮,振動刺激可以促使肌纖維類型由Ⅰ型向Ⅱ型的轉化,并且促進其Ⅰ型肌纖維數(shù)量的明顯增加[12]。本研究又從分子水平角度證實振動訓練能夠提高Myf-5的蛋白表達來提高蛋白質的合成率,為以后治療運動廢用性肌肉萎縮疾病提供了新的思路和途徑。

4 結論

1)振動刺激干預可以促進SMDA大鼠肌肉肌纖維肌型的轉化及I型、II型數(shù)量的變化。

2)20Hz和30Hz頻率振動干預均可提高SMDA大鼠骨骼肌中的Myf-5蛋白表達水平。

3)低頻(20Hz)較高頻(30Hz)刺激對SMDA大鼠肌肉Myf-5蛋白表達水平效果更顯著。

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Effects of Vibration Stimulate on Myf-5 in SMDA Rats Muscle with Disuse Atrophy

LIN Yufeng1,LI Yanting2,HE Jianwei3
(1.Longyan Institute,Longyan 364012,Fujiang,China;2.P.E.School of Harbin Industry University,Harbin 150001,Heilongjiang,China;3.Department of P.E.,Putian University,Putian 351100,Fujian,China)

Objective:To study the effects on Myf-5 content in rats gastrocnemius muscles by vibrate stimuli,which express the role of the SMDA by the Vibration stimulation further.Methods:40 Female SD rats were assigned randomly to one of the five groups:simultaneous control(A),Suspension plus low frequency vibration stimulate(B),Suspension plus high frequency vibration stimulate(C),Suspension(D),and Suspension control(E).gastrocnemius muscles of Group A were examined 14 days later,and other 4 groups were examined after 2 weeks’vibration stimuli.The change of Myf-5 was measured by Western blotting.Results:Compared with that of group A,the expression of Myf-5 in group D was significantly reduced(P＜0.05).Compared with group D,the expression of Myf-5 recovered completely in group B&C(P＜0.05).Conclusion:20Hz and 30Hz vibration stimulation intervention can improve muscle Myf-5 expression levels,and low frequency vibration training(20Hz)is more obvious stimulus effects than high frequency vibration training(30Hz).

SMDA;vibration stimuli;Myogenic Factor-5;gene expression

G804.7

A

1004-0560(2013)03-0093-03

2012-10-11;

2012-12-26

林宇峰(1963-),男,副教授,主要研究方向為運動醫(yī)學。

何建偉(1973-),男,副教授,博士,主要研究方向為運動人體科學,E-mail:hjw-1204@163.com。

責任編輯:劉紅霞