太子參總皂苷含量測定方法研究

張 敏，王慧娟，林 冰，趙 致，周 英，3*

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025;2.貴州大學(xué)貴州省中藥(民族藥)創(chuàng)制工程中心，貴州貴陽550025;3.貴州大學(xué)貴州省中藥材繁育與種植重點(工程)實驗室，貴州貴陽550025)

太子參為石竹科Caryophyllaceae植物孩兒參Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根，始見于清代的《本草從新》。黃文哲等在研究太子參6個不同極性提取物對小鼠免疫功能的影響時，發(fā)現(xiàn)太子參中的苷類和多糖等大極性成分是太子參提高機體免疫功能的有效物質(zhì)［1］;熊和健等通過研究太子參提取物體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)太子參皂苷粗提物具有明顯抗氧化活性［2］。

雖然太子參皂苷的藥理作用已經(jīng)逐漸明確，但關(guān)于太子參皂苷的含量測定研究還較為鮮見。由于缺少對照品，目前使用最多的方法是太子參藥材粉末經(jīng)水提醇沉后，濾液用正丁醇萃取后制備成供試液，以人參皂苷為標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用香草醛－高氯酸顯色后于可見光區(qū)測定［3］。但該方法工作量較大，工作效率較低，易造成總皂苷的損失，導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。因此，本研究參照人參、重樓等貴重藥材的總皂苷測定方法，旨在缺少太子參皂苷自身對照品的情況下，建立太子參總皂苷含量的快速測定法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥 太子參藥材粉末，購于貴州省藥材公司。

1.1.2 儀器與試劑FA2004型分析天平(上海良平儀器儀表有限公司);恒溫水域鍋(金壇市大地自動化儀器廠);SHZ－95B型循環(huán)水壓式多用真空泵(上海予正儀器設(shè)備有限公司);SG8200HPT超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司);SZ－93A自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠);GZX－9146MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);722S可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)。人參皂苷Rb1(中國食品藥品檢定研究院);無水乙醇(AR，重慶川東化工集團有限公司);濃硫酸(AR，重慶川東化工集團有限公司);香草醛(AR，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心);高氯酸(AR，成都金山化學(xué)試劑有限公司);冰乙酸(AR，天津市永大化學(xué)試劑有限公司);甲醇(AR，重慶川東化工集團有限公司);正丁醇(AR，成都金山化學(xué)試劑有限公司);雙蒸水(自制)。

1.2 方法

1.2.1 供試液制備單因素考察 根據(jù)文獻中人參皂苷的超聲波半微量提取快速測定法［4］，稱取過藥典5號篩的太子參藥材粉末0.1 g于具塞錐形瓶中，加入25 mL溶劑，超聲40 min(功率500 W，頻率50 Hz)，取出后抽濾，取5 mL續(xù)濾液于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，作為供試液。取供試液2 mL置于10 mL具塞試管中，于沸水浴下?lián)]去溶劑，加入5%的香草醛－冰醋酸溶液(用前臨時配制)0.2 mL和0.8 mL高氯酸混勻，密塞，置60℃水浴中加熱20 min后取出，用冷水冷卻后，加入5 mL冰醋酸，搖勻。另取相同體積甲醇為空白對照，于560 nm波長處測定吸光度，并計算總皂苷占生藥的含量(%)。

(1)提取溶劑考察。分別以甲醇、無水乙醇、水飽和的正丁醇為提取溶劑，制備太子參供試液，測定總皂苷含量分別為2.72%、0.66%、2.14%。使用不同提取溶劑，供試液中引入的雜質(zhì)不同。根據(jù)文獻報道，太子參中所含的皂苷總量不超過1.0%［3］。因此，選用無水乙醇為溶劑時所制得的皂苷供試液中雜質(zhì)最少。本研究選用無水乙醇為提取溶劑。

(2)料液比的篩選。稱取過藥典5號篩的太子參藥材粉末0.1 g于具塞錐形瓶中，分別加入10、15、20、25 mL無水乙醇溶液，超聲提取后測定總皂苷含量分別為0.62%、0.73%、0.71%、0.66%。皂苷含量與加入的溶劑量為非正相關(guān)關(guān)系，溶劑量增大到一定值，皂苷含量反而減少。當(dāng)稱取0.1 g藥材加入15 mL無水乙醇時，所制得的供試液中總皂苷含量最高。因此，本研究選擇加入15 mL無水乙醇制備供試液。

(3)藥材粒度的篩選。分別稱取過藥典3、5、6、7、8號篩的樣品藥材0.1 g，再分別加入15 mL無水乙醇溶液，超聲提取后測定總皂苷含量分別為0.48%、0.73%、0.74%、0.75%、0.74%。當(dāng)藥材粒度為過藥典7號篩時所測得的皂苷含量最高。而過藥典8號篩與過藥典6號篩所測定的結(jié)果一致，可能是由于過8號篩的藥材粒度過小，部分藥渣堵塞濾紙，導(dǎo)致結(jié)果偏低。因此，本研究選用過藥典7號篩的藥粉進行測定。

(4)提取時間的篩選。分別稱取樣品藥材粉末0.1 g(過藥典7號篩)加入15 mL無水乙醇后，分別超聲提取20、30、40、60、90、120、150 min，測定總皂苷含量分別為0.45%、0.65%、0.75%、0.76%、0.78%、0.79%、0.73%。試驗可知，提取時間為120 min時制備的供試液皂苷含量測定值最高。在120 min之前測定的皂苷含量隨提取時間的增加而升高。當(dāng)提取時間為150 min時，測定結(jié)果明顯降低，可能是由于超聲150 min后，提取溶劑升溫，導(dǎo)致部分待測成分結(jié)構(gòu)改變，使測定結(jié)果降低。由于提取90 min與提取120 min皂苷測定值基本相等，考慮到工作效率，本研究選用提取90 min進行測定。

1.2.2 供試液制備 稱取太子參藥材粉末0.1 g(過藥典7號篩)，加入無水乙醇15 mL，超聲提取90 min，過濾后取續(xù)濾液5 mL于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，作為供試液備用。

1.2.3 供試液顯色系統(tǒng)篩選 鑒于太子參總皂苷測定中缺少從太子參中分離得到的對照品，因此，選用化學(xué)結(jié)構(gòu)相近的人參皂苷Rb1對照考察了供試液測定時的顯色系統(tǒng)。取太子參供試液2 mL于具塞試管中，水浴揮干溶劑后，分別按下列顯色系統(tǒng)于560 nm處進行顯色反應(yīng)，測定吸光度;同時稱取10.76 mg人參皂苷Rb1用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，混合均勻后，取0.2 mL于具塞試管中，水浴揮干溶劑，分別按下列顯色系統(tǒng)進行顯色反應(yīng):

(1)加入高氯酸5 mL，置25℃水浴中保溫20 min，取出冷卻至室溫后測定［5］。

(2)加入5%香草醛－冰醋酸溶液0.2 mL，搖勻后，加入60%硫酸溶液5 mL，混合均勻后于60℃水浴中保溫20 min，取出冷水冷卻后測定［6］。

(3)加入8%香草醛－乙醇溶液0.2 mL，搖勻后，加入60%硫酸溶液5 mL，混合均勻后于60℃水浴中保溫20 min，取出冷水冷卻后測定［6］。

(4)加入5%香草醛－冰醋酸溶液0.2 mL，搖勻后，加入高氯酸0.8 mL，混合均勻后于60℃水浴中保溫20 min，取出冷水冷卻后加入5 mL冰醋酸溶液，搖勻后測定吸光度［7］。

(5)稱取香草醛0.1 g于10 mL的容量瓶中，加入2 mL冰醋酸和8 mL高氯酸，配置成5%香草醛－冰醋酸和高氯酸的1∶4的混合液，取上述混合液1 mL，于樣品具塞試管中搖勻后，置于60℃水浴中保溫20 min，取出冷水冷卻后加入5 mL冰醋酸溶液，搖勻后測定吸光度［8］。

每種顯色系統(tǒng)分別用太子參皂苷供試液和人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)液(0.45 mg/mL，每次0.2 mL參與反應(yīng))同步測定初始吸光度(A0min)和60 min時的吸光度(A60min)，并計算吸光度的改變率。綜合考察顯色系統(tǒng)的靈敏度和穩(wěn)定性，篩選顯色系統(tǒng)。吸光度的改變率計算公式如下:

1.2.5 供試液制備正交設(shè)計優(yōu)化 由單因素考察試驗可知，當(dāng)選定提取溶劑后，藥材顆粒度、料液比、提取時間3個因素對總皂苷含量影響較大，因此，以這3個因素設(shè)計了L9(34)3因素3水平的正交試驗(表1)。

表1 正交試驗方案Tab.1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.4 方法學(xué)考察

(1)線性關(guān)系考察。對照品溶液制備:稱取人參皂苷Rb1對照品4.5 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:吸取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL，分別置于10 mL具塞試管中，于水浴下?lián)]去溶劑，加入5%香草醛－冰醋酸溶液0.2 mL，搖勻后，加入60%硫酸溶液5 mL，混合均勻后于60℃水浴中保溫20 min，取出冷水冷卻后測定吸光度。以甲醇為空白對照，于560 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以人參皂苷Rb1對照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，測得的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)精密度試驗。按1.2項下太子參皂苷供試液制備的方法，制備皂苷供試液，吸取供試液2 mL，按上述線性關(guān)系中測定方法，從“水浴下?lián)]去溶劑”開始測定吸光度，計算RSD值。

(3)穩(wěn)定性試驗。按1.2項下太子參皂苷供試液制備的方法，制備皂苷供試液，吸取供試液2 mL，按上述線性關(guān)系中測定方法，從“水浴下?lián)]去溶劑”開始，每隔20 min測定1次吸光度，計算RSD值。

(4)重復(fù)性試驗。按1.2項下太子參皂苷供試液制備的方法，平行稱取6份太子參藥材，制備太子參皂苷供試液，吸取供試液2 mL，按上述線性關(guān)系中測定方法，從“水浴下?lián)]去溶劑”開始，測定吸光度并計算RSD值。

(5)加樣回收率試驗。稱取已知總皂苷含量的樣品粉末0.05 g(過7號篩)，平行稱取5份，分別加入相同質(zhì)量的人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品0.4 mg。按1.2項下太子參皂苷供試液制備的方法，制備皂苷供試液，取供試液2 mL，按上述線性關(guān)系中測定方法，從“水浴下?lián)]去溶劑”開始，測定吸光度，計算平均回收率以及RSD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色系統(tǒng)篩選

由于太子參總皂苷的含量是以人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定的，在選擇顯色系統(tǒng)時要綜合考慮人參皂苷Rb1和太子參皂苷供試液對顯色系統(tǒng)的靈敏性及穩(wěn)定性。由試驗結(jié)果可知(表2)，顯色系統(tǒng)②的靈敏性與穩(wěn)定性都相對最高，因此，選定②號顯色系統(tǒng)進行測定。即:向已揮干溶劑的供試液具塞試管中加入5%香草醛－冰醋酸溶液0.2 mL，搖勻后，加入60%硫酸溶液5 mL，混合均勻后于60℃水浴中保溫20 min，取出冷水冷卻后于560 nm處測定吸光度。

表2 顯色系統(tǒng)考察結(jié)果Tab.2 Results of color conditions inspection

2.2 正交試驗結(jié)果

由單因素考察試驗可知，當(dāng)選定提取溶劑后，藥材顆粒度、料液比、提取時間3個因素對總皂苷含量影響較大，因此，以這3個因素設(shè)計了L9(34)3因素3水平的正交試驗，結(jié)果見表3。從表3可見，A2B3C3為較優(yōu)的總皂苷供試液制備條件，即太子參總皂苷供試液制備方法為:稱取太子參藥材粉末0.1 g(過藥典7號篩)，加入無水乙醇20 mL，超聲提取120 min，過濾后，取續(xù)濾液5 mL于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，作為供試液。

2.3 線性關(guān)系與方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 線性關(guān)系 以人參皂苷Rb1對照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，測得的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。得到回歸方程:A=0.017 6C+0.011 3，R2=0.999 5，線性范圍:7.94～40.89 μg/mL。

表3 正交試驗結(jié)果Tab.3 The results of orthogonal test

圖1 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of ginsenside Rb1

2.3.2 精密度試驗 按1.2項下太子參皂苷供試

液制備的方法，制備太子參供試液，連續(xù)測定5次，吸光度分別為0.155、0.152、0.156、0.154、0.154，計算得到RSD值為0.96%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 按1.2項下太子參皂苷供試液制備的方法，制備太子參供試液，分別測定0、20、40、60、80、100 min時的吸光度，分別為0.155、0.152、0.154、0.156、0.154、0.155，計算得到RSD值為0.88%，表明該測定方法于1 00 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗 按1.2項下太子參皂苷供試液制備的方法，平行稱取6份同一批次太子參藥材，制備太子參供試液，測定皂苷含量。計算得到RSD值為1.97%(表4)，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 平行稱取5份已知皂苷含量的同一產(chǎn)地太子參藥材，分別加入人參皂苷0.4 mg，按1.2項下太子參皂苷供試液制備的方法，制備太子參供試液，測定皂苷含量。計算RSD值為1.25%，平均回收率為98.82%(表5)，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表4 重復(fù)性試驗結(jié)果Tab.4 Results of repeatability test

表5 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.5 Results of sample recover test

3 討論

3.1 太子參皂苷不僅具有增強免疫力等藥理作用［1］，其含量還可以在一定程度上表征太子參生長的環(huán)境變化［9］，因此，太子參的皂苷含量在太子參的質(zhì)量控制中具有重要作用。目前，由于太子參皂苷在測定中缺少自身標(biāo)準(zhǔn)品，所測得的含量多為一種模糊值，使太子參的質(zhì)量控制受限。本試驗得到的超聲波半微量提取測定法，較其他方法具有快捷、靈敏、取樣少等優(yōu)點，在缺少太子參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的測定研究中，具有一定的應(yīng)用價值。但若想使太子參皂苷作為一個指標(biāo)性成分在太子參質(zhì)量控制中得到更好的應(yīng)用，還需要在太子參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品方面深入研究。

3.2 超聲波是一種機械波，在不均勻介質(zhì)中傳遞時會發(fā)生散射衰減，試驗超聲提取時，樣品整體作為一種介質(zhì)在各方向上是不均勻的，到達樣品內(nèi)部的超聲機械能量會有一定程度的衰減，從而影響提取效果［4］。本試驗采用0.1 g的藥材用量，其原因:一是可以使藥材不受震動、搖晃等影響，在250 mL的具塞錐形瓶中都能平鋪于瓶底，堆積厚度較小，降低了超聲波的衰減;二是使試劑對樣品內(nèi)部的浸提作用更充分;三是當(dāng)藥材用量較小時，可以在一定程度上忽略雜質(zhì)干擾。

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