鴨肉蛋白酶解液制備的工藝優(yōu)化

褚仕超，孫 彥，劉章武

(武漢工業(yè)學院食品科學與工程學院，湖北武漢 430023)

肉類香精是一種具有動物肉類制品香味的食用香精，自20世紀80年代起在我國得到發(fā)展［1］。其廣泛應用于新型加香產品中，如方便食品、調味品、肉制品及膨化休閑食品等，可提高食品品質，增添獨特風味。目前，研究人員對禽肉香精［2－7］和海鮮香精［8］進行了比較廣泛深入的探索，但對鴨肉香精的研究不多。因為香味獨特，鴨肉作為湖北的傳統(tǒng)特色產品在本省及全國都非常受歡迎。為滿足潛在市場需求，對鴨肉蛋白進行適當的水解即可得到風味純正、香氣逼真的鴨肉香精。其中酶法水解蛋白因其獨特優(yōu)勢，已逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酸堿水解法，成為更加高效的水解方法［9－11］。為制備風味好、香型真的鴨肉香精，利用不同組合的蛋白酶對鴨肉進行水解，為后面利用美拉德反應制得香味逼真的鴨肉香精打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨肉由精武公司提供;肉類水解專用酶和風味蛋白酶均來自廣西南寧東恒華道生物科技有限責任公司;氫氧化鈉、鹽酸、甲醛等均為分析試劑純。

1.2 儀器與設備

FSH-2A可調高速勻漿機(金壇市醫(yī)療儀器廠);TDL-40型飛鴿離心機(上海安亭科學儀器廠);90-2型定時恒溫磁力攪拌器(上海滬西分析儀器廠);pH計(Delta320，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司);HH-S型水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠);SYC15超級智能恒溫水槽(鞏義市英峪予華儀器廠);JBT/C-YCL400T/3(C)超聲波處理機(濟寧金百特公司)。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質含量測定

凱氏定氮法［12］

1.3.2 蛋白質水解度(DH)的測定

DH=上清液中的氨基態(tài)氮/鴨肉樣品中總氮量×100%

1.3.3 氨基酸氮含量的測定

雙指示劑甲醛滴定法［13］.

1.3.4 酶解方法

將去皮的鴨腿肉解凍后絞碎，按1∶4的料液比將鴨肉與蒸餾水勻漿，然后通過超聲波預處理后［14－15］，調節(jié)至特定 pH 值，將樣品放入適當溫度的恒溫水浴鍋中加熱，再加入蛋白水解酶酶解適當時間。最后將酶解液在90℃條件下滅酶10 min，然后離心并取上清液，靜置至室溫后測其水解度［16］。

1.3.5 酶解的單因素試驗

為選定酶解過程中的最適工藝條件，選取不同的復合酶酶比、加酶量、水解時間、初始pH值、水解溫度等5個因素來進行單因素試驗。

1.3.6 酶解的正交試驗

根據單因素試驗結果，選用復合酶酶比、加酶量、水解時間、初始pH值、水解溫度等5個因素中的合適參數進行五因素四水平正交試驗，從而確定最優(yōu)酶解條件。正交試驗的各因素和水平見表1。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 最佳復合酶比的確定

肉類水解專用酶與風味蛋白酶的比例不同對酶解反應會有影響。選定酶解條件為:pH7.5，溫度55℃，加酶量0.3%(W/W)，在肉類水解專用酶:風味蛋白酶為 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 的條件下，將鴨肉漿水解4h后，升溫滅酶，并測定其水解度。實驗結果見圖1。

圖1 不同酶比對水解的影響

由圖1可知，不同的酶比的酶解度也不同。酶解度與酶比之間的關聯呈先升后降趨勢，當肉類水解專用酶∶風味酶為2∶1時，酶解度最高，達到34.41%。

2.1.2 最佳加酶量的確定

選定酶解條件為:pH 7.5，溫度55℃，酶比為2∶1，分別在加酶量為 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%(W/W)的條件下，對鴨肉漿水解4 h，酶解結束后升溫滅酶，并測定其水解度。實驗結果見圖2。

圖2 不同加酶量對水解度的影響

由圖2可知，加酶量的不同對酶解度的影響呈現出先上升后趨于平衡的趨勢。當加酶量小于0.3%時，加酶量增加，水解度增大，而當加酶量大于0.3%時，水解度基本上沒什么變化。由于加酶量在0.3%時所得水解液顏色質地清亮，風味比較好。所以從經濟成本和風味方面兩方面考慮，確定加酶量為 0.3%。

2.1.3 水解時間的確定

選定酶解條件為:溫度55℃，pH7.5，加酶量為0.3%(W/W)，肉類水解專用酶∶風味蛋白酶 =2∶1，對鴨肉漿水解8 h，每隔1 h取樣滅酶，并測定其水解度。實驗結果如圖3。

從圖3可知，水解時間增加，鴨肉蛋白的水解度也增加。在反應的前4個小時，水解度增加得比較快，4個小時后水解度變化趨緩。這主要是由于剛加入酶時，底物濃度較高，反應速率隨著酶的不斷加入而變快。當鴨肉蛋白質底物逐漸被酶解后，底物濃度下降，酶解速率也隨之下降。同時，隨著反應時間越來越長，溫度越來越高，也可使部分酶發(fā)生變性，導致酶解后段速度下降。而且實驗表明，當水解時間超過4 h后，水解液風味開始變差，所以綜合考慮后選定鴨肉水解最適宜時間為4 h。

圖3 不同水解時間對水解度的影響

2.1.4 最佳酶解溫度的確定

溫度影響酶的活力，同時也會影響酶解過程中輕度發(fā)生的美拉德反應，從而對酶解液的風味和色澤產生影響。選定酶解條件為:pH7.5，加酶量為0.3%(W/W)，肉類水解專用酶∶風味酶=2∶1，分別在45℃、50℃、55℃、60℃下，對鴨肉漿水解4h，酶解后升高溫度對其滅酶，并測定其水解度。其結果見圖4。

圖4 不同水解溫度對水解度的影響

由圖4可知，選擇合適的酶解溫度對酶解反應的速率具有重要的影響，且水解液的風味和色澤也會受溫度的影響。當溫度低于50℃時，隨著反應溫度的增加，水解度也逐步上升，達到33.20%。當溫度超過50℃時，酶解度也漸漸降低。這主要是由于酶具有最適反應溫度，在一定的溫度范圍內，溫度升高，酶活力增大，酶促反應速率加快。當酶超過其適應溫度范圍變性后，酶的活性便會降低。因此，確定酶解溫度為50℃。

2.1.5 水解最佳pH的確定

選定酶解條件為:溫度55℃，加酶量為0.3%(W/W)，肉類水解專用酶與風味酶酶比為2∶1，分別在 pH 為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的條件下，對鴨肉漿水解4 h，酶解后迅速升溫滅酶，并測定其水解度。實驗結果見圖5。

由圖5可見，不同的pH下，酶解反應的速度也會不同，pH偏高或偏低都不利于酶解反應的進行。因為酶有最適酸堿范圍，過酸或過堿都會影響到酶的活性和穩(wěn)定性，從而影響酶解反應的速度，使得酶解反應的水解度下降。因此，確定酶解pH為7.5。

圖5 不同pH對水解度的影響

2.2 正交實驗結果

為更全面的照顧到各單因素對酶解效果的影響，實驗將水解度作為優(yōu)化指標，對復合酶的酶比、加酶量、水解溫度、水解時間和pH等5個因素進行優(yōu)化設計。表1為酶解實驗設計因素與水平，表2為酶解實驗正交設計方案及實驗結果。

表1 酶解的因素和水平

表2 酶解的正交實驗結果

2.3 最佳酶解條件的確定

對正交表中的數據進行極差分析，可以看出，各單因素對水解度的影響從大到小分別為:pH、水解溫度、酶比、水解時間、加酶量。而最佳的試驗組合為:酶比2∶1，水解時間5 h，水解溫度50℃，加酶量0.3%(W/W)，pH7.5。但該組合并沒有出現在正交實驗中，通過補充該組實驗可知，在所得水解度為34.1%時，最佳水解條件為:酶比2∶1，水解時間5 h，水解溫度50 ℃，加酶量0.3%(W/W)，pH7.5。

3 結論

在鴨肉酶解的初段，隨著時間的增加，水解度也快速的增長，而到了酶解后期，水解度隨時間的增加就會增長得比較緩慢。對水解度影響比較明顯的還有水解溫度和起始pH，溫度過高或者過低，以及水解環(huán)境過酸或者過堿都會影響酶的活性，從而導致水解度相對比較低。達到一定數值的加酶量，如果繼續(xù)加大加酶量，水解度上升便會變得緩慢。其主要原因在于，在一定底物濃度下，加酶量較低時，酶可能已經飽和，于是加酶量越大，酶解速率就會越高。進一步增加加酶量，酶的濃度在反應體系中升高，兩種酶之間就會產生相互抑制，水解度的變化就不會太明顯。此外，試驗還研究了不同配比下肉類水解專用酶和風味蛋白酶組成的復合酶對水解度的影響，結果表明，不同比例的復合酶，水解度也會有差異。

正交實驗及其分析對復合蛋白酶水解工藝所進行的優(yōu)化，可以得出酶解的最佳工藝條件為:酶解時間5 h;酶解溫度50℃;酶解起始pH 7.5;酶比為肉類水解專用酶∶風味蛋白酶=2∶1;加酶量0.3%(W/W)。而通過研究人員在其他肉類香精方面的研究可知，肉類蛋白酶解液的水解度在30%左右時進行Maillard反應便于形成較好的肉類香氣和風味。［17－18］

［1］潘麗紅，周光宏，徐幸蓮，等.美拉德反應在肉味香精生產中的應用［J］.肉類工業(yè)，2007(8):29－31.

［2］陳能飛，李衛(wèi)華，張書敏，等.肉類香精的研究概況及其應用［J］.食品工業(yè)科技，2007，28(1):245－246.

［3］王林山，楊玉娟，李應華.肉味香精及其肉制品中的應用［J］.中國食品添加劑，2004(5):63－66.

［4］譚斌.Maillard反應體系制備熱加工牛肉風味基料的研究［D］.無錫:江南大學，2005.

［5］朱新生.熱反應豬肉風味香精的研究與制備［D］.無錫:江南大學，2005.

［6］楊二剛.酶解雞肉制備熱反應天然鴨肉香精的研究［D］.無錫:江南大學，2008.

［7］岑泳延.雞肉酶解及熱反應雞肉香精的研究［D］.廣州:華南理工大學，2003.

［8］孟紹鳳.蝦風味的分析和風味基料的制備［D］.無錫:江南大學，2006.

［9］譚斌，丁霄霖.牛肉蛋白水解物的酶解制備［J］.無錫輕工業(yè)大學學報，2005(1):59－64.

［10］湯高奇，柳艷霞，楊繼紅.酸法水解動物蛋白工藝研究［J］.楊凌職業(yè)技術學院學報，2004(12):6 －7，17.

［11］楊晉.利用酶解技術和梅拉德反應制備海鮮調味料的研究［D］.上海:上海水產大學，2007.

［12］GB/5009.5－2003.食品中蛋白質的測定［S］.

［13］謝音，屈小英主編.食品分析［M］.北京:科學技術文獻出版社.2006:89－90.

［14］胡愛軍，丘泰球.超聲技術在食品工業(yè)中的應用［J］.聲學技術，2002(4):192－194.

［15］陳海燕.熱反應鴨肉香精的研究與制備［D］.南京:南京農業(yè)大學，2006(11):33.

［16］Meara G M，Munro P A.Effects of reaction variables on the hydrolysis of lean beef tissue by alcalas［J］.Meat Science，1984(11):227－238

［17］張彩菊，張敏.利用美拉德反應制備魚味香料［J］.無錫輕工業(yè)大學學報，2004(9):11－15.

［18］潘麗紅.熱反應鴨肉香精的研究與制備［D］.南京:南京農業(yè)大學，2008.