固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豬肉中玉米赤霉醇類的殘留量

李麗萍， 范 賽， 趙 榕， 李 兵， 劉 偉， 吳國(guó)華

(北京市疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生所，北京 100013）

α-玉米赤霉醇(ZER）屬于雷索酸內(nèi)酯類(RALs）物質(zhì)，同類物質(zhì)還包括β-玉米赤霉醇(β-ZAL）、玉米赤霉酮(ZAN）、玉米赤霉烯酮(ZEN）、α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL）和 β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL），其結(jié)構(gòu)相似［1－3］。RALs 物質(zhì)是非甾體類雌性激素，ZER作為家畜增重的外源激素效果良好，被廣泛用于動(dòng)植物的促生長(zhǎng)。20世紀(jì)70年代歐美國(guó)家就已將玉米赤霉醇作為牛羊增重劑，80年代傳入我國(guó)。有數(shù)據(jù)表明雷索酸內(nèi)酯類是致畸和致癌物，ZER在動(dòng)物組織殘留會(huì)引起人體性機(jī)能紊亂及影響第二性征的正常發(fā)育，其排出體外后還可經(jīng)水和食物造成二次污染和環(huán)境污染［4－6］。ZEN具有免疫毒性、肝毒性，對(duì)腫瘤的發(fā)生也有一定影響，其廣泛存在于谷物及其他農(nóng)作物中，極易被用于飼料而進(jìn)入畜產(chǎn)品體內(nèi)造成殘留，進(jìn)而對(duì)人體健康造成威脅［7，8］。為了確保人類健康，我國(guó)、歐盟以及世界糧農(nóng)組織先后明確禁止將激素類物質(zhì)應(yīng)用于家畜生產(chǎn)［8－11］。但由于玉米赤霉醇作為畜禽產(chǎn)品促生長(zhǎng)劑的效果明顯，部分違法者仍在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中使用玉米赤霉醇，導(dǎo)致玉米赤霉醇可能會(huì)殘留在各種食用組織中。因此，研究和開發(fā)動(dòng)物源性食品中玉米赤霉醇類藥物的分析技術(shù)，對(duì)于食品安全檢測(cè)具有重要意義。

目前，針對(duì)玉米赤霉醇類物質(zhì)的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA）、薄層色譜法(TLC）［12－14］、高效液相色譜法(HPLC）［15，16］、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS）［17，18］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (LC-MS/MS）［19－23］等。免疫技術(shù)或酶聯(lián)免疫技術(shù)雖然靈敏度高，簡(jiǎn)便快速，但假陽(yáng)性率不可避免，一般用于樣品篩選;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法通常需要復(fù)雜的衍生步驟使待測(cè)物轉(zhuǎn)化為氣相色譜可分析的化合物，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法則需要對(duì)樣品進(jìn)行較徹底的凈化以改善待測(cè)物在質(zhì)譜上的基質(zhì)抑制效應(yīng)。所用樣品前處理技術(shù)多為液-液萃取，操作繁瑣且需要使用大量的有機(jī)溶劑反復(fù)萃取。本文通過(guò)HLB小柱固相萃取進(jìn)行富集凈化和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-MS/MS）進(jìn)行分離檢測(cè)，方法簡(jiǎn)便快速、可節(jié)省大量溶劑，對(duì)環(huán)境友好，可以滿足對(duì)市場(chǎng)上動(dòng)物源性食品中痕量玉米赤霉醇類物質(zhì)的監(jiān)管需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITYTM超高效液相色譜儀、MICROMASSTM-Quattro premier XE質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司）。T25 Basic型均質(zhì)器(德國(guó) IKA公司）。Oasis HLB柱(150 mg，6 mL），ENVI-Carb GCB固相萃取小柱(500 mg，6 mL;美國(guó)Supelco公司），ENVI-Carb-NH2GCB固相萃取小柱(500 mg，6 mL;美國(guó)Supelco公司），HPLC級(jí)甲醇、乙腈(Dikma公司）。

α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，同位素內(nèi)標(biāo)α-玉米赤霉烯醇-D7、β-玉米赤霉烯醇-D7均購(gòu)自加拿大TRC公司。β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶購(gòu)自美國(guó)羅氏公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成質(zhì)量濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于－20℃冰箱保存。需要時(shí)各取儲(chǔ)備液0.1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，并用甲醇稀釋成10 mg/L的混合中間液，使用前將中間液以甲醇稀釋配制成1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液。同位素內(nèi)標(biāo)α-玉米赤霉烯醇-D7和β-玉米赤霉烯醇-D7單獨(dú)配制成10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，使用前將中間液以甲醇稀釋配制成1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液作為標(biāo)準(zhǔn)使用液。兩種溶液均于避光、－20℃下保存。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g均質(zhì)豬肉樣品，加入20 μL的1.0 mg/L內(nèi)標(biāo)溶液和10 mL pH 5.2的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，渦旋混勻、超聲30 min，再加入β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶溶液100 μL，于(37±1）℃振蕩酶解12 h，取出后冷卻至室溫，加入25 mL甲醇超聲提取30 min，0～4℃下以10000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一潔凈試管中，待凈化。Oasis HLB柱(6 mL，150 mg）依次用6 mL甲醇、6 mL水活化，提取液上柱后，用3 mL超純水淋洗小柱，減壓抽干。以6 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，在40℃下氮?dú)鉂饪s至干，殘留物用初始流動(dòng)相復(fù)溶后過(guò)0.22 μm的有機(jī)濾膜供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）;柱溫:40 ℃;樣品室溫度:4℃;進(jìn)樣體積:5 μL。流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈;梯度洗脫程序:0～5 min，65%A線性降到40%A;5～5.10 min，40%A線性降到5%A，并保持到7.50 min;7.50～8.00 min，5%A降到0%A，并保持到8.50 min;8.50～9.00 min，0%A線性升到 65%A，并保持到 10.0 min。流速為 0.3 mL/min。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離方式:電噴霧負(fù)離子模式(ESI－）;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM）采集，駐留時(shí)間0.10 s;毛細(xì)管電壓:2.70 kV;錐孔電壓:45 V;離子源溫度:100℃;脫溶劑溫度:400℃;脫溶劑氣流量:600 L/h;碰撞室壓力:0.33 Pa。其他質(zhì)譜條件見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下6種化合物的檢測(cè)參數(shù)Table 1 MRM parameters of the six compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

通過(guò)流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣200 μg/L以甲醇-水溶液(50∶50，v/v）為溶劑的單標(biāo)準(zhǔn)溶液，并同時(shí)開啟液相色譜，設(shè)定其流動(dòng)相為甲醇-水溶液(50∶50，v/v），流速為50 μL/min。在此條件下對(duì)質(zhì)譜參數(shù)如毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、脫溶劑氣流速等參數(shù)進(jìn)行了正、負(fù)離子優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見1.4.2節(jié)。玉米赤霉醇及其類似物均屬于二羥基苯甲酸內(nèi)酯類化合物，其苯環(huán)上都有2個(gè)羥基，呈弱酸性。在液相色譜-電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)易失去質(zhì)子而產(chǎn)生［M－H］－準(zhǔn)分子離子。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，結(jié)果表明6種玉米赤霉醇類物質(zhì)均在負(fù)離子模式下產(chǎn)生［M－H］－的最強(qiáng)準(zhǔn)分子離子峰。從理論上推測(cè)，偏堿性的流動(dòng)相更易提高ESI－模式下目標(biāo)化合物的響應(yīng)。因此，本研究考察了分別以0.1%氨水溶液-甲醇、10 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇、純水-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%氨水溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈、純水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)目標(biāo)化合物色譜行為與質(zhì)譜響應(yīng)的影響。但結(jié)果顯示，以純水和乙腈為流動(dòng)相時(shí)，6種目標(biāo)物質(zhì)分離完全，靈敏度最高。因此，本研究最終選擇水和乙腈為流動(dòng)相。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

玉米赤霉醇類化合物是一種類雌激素物質(zhì)，在動(dòng)物組織中會(huì)以硫酸軛合物或葡萄糖醛酸軛合物等形式存在，因此樣品要先進(jìn)行水解，使待測(cè)物游離或從組織中釋放以進(jìn)行后續(xù)的提取工作。目前，對(duì)于動(dòng)物源性食品中玉米赤霉醇類物質(zhì)的提取方式國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，但多集中于使用乙醚、丙酮、正己烷和乙酸乙酯等極性相對(duì)較弱的提取液進(jìn)行提取，經(jīng)NaOH溶液反萃后，再用反相固相萃取柱凈化［24］。方法步驟繁瑣，且耗費(fèi)大量的溶劑。如農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-19-2008和GB/T 21982-2008，二者在檢測(cè)手段上與本文相差不大，但前處理過(guò)程則較為復(fù)雜［23，24］。農(nóng)業(yè)部 1025 號(hào)公告-19-2008 中酶解后首先采用正己烷反復(fù)萃取，旋蒸至近干后再用乙酸乙酯復(fù)溶才能過(guò)SPE小柱凈化;而GB/T 21982-2008中酶解后首先采用乙醚反復(fù)萃取，旋蒸至近干后再用二氯甲烷復(fù)溶，還要經(jīng)NaOH溶液反萃才能過(guò)SPE小柱凈化。而對(duì)植物性食品中玉米赤霉醇類物質(zhì)的報(bào)道則多集中于使用84%乙腈水溶液進(jìn)行提?。?9］?？紤]到玉米赤霉醇類物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)類似，因此本實(shí)驗(yàn)嘗試采用了甲醇水溶液作為提取液進(jìn)行提取，避免了采用正己烷或乙醚提取而產(chǎn)生的脂類雜質(zhì)的干擾，省去了采用NaOH溶液反萃的去脂過(guò)程，從而減少了提取步驟，并優(yōu)化了提取效率，避免了反復(fù)轉(zhuǎn)移所帶來(lái)的目標(biāo)物損失，凈化效果對(duì)比如圖1所示，低水平加標(biāo)的離子流圖如圖2所示。并且由于精簡(jiǎn)了提取過(guò)程，也減少了大量有機(jī)溶劑的使用和工作時(shí)間，對(duì)環(huán)境友好，更適用于大量樣品的監(jiān)測(cè)工作。通過(guò)對(duì)酶解后的溶液分別加入10、15、20、25、30 mL 的甲醇進(jìn)行提取，并搭配 ENVICarb固相萃取柱、NH2固相萃取柱、ENVI-Carb固相萃取柱串接NH2固相萃取柱、HLB固相萃取柱進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果顯示，HLB固相萃取柱能同時(shí)滿足6種玉米赤霉醇類化合物的凈化要求，效果最佳。HLB柱在20 μg/kg加標(biāo)水平下，不采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算的絕對(duì)回收率均可以達(dá)到80%以上，其他兩種小柱或兩種小柱的組合其絕對(duì)回收率只有30%～50%，且部分化合物沒(méi)有檢出。因此本研究最終選定HLB柱作為凈化手段。

2.3 方法的線性關(guān)系、檢出限與定量限

圖1 采用(a）國(guó)標(biāo)方法與(b）本方法對(duì)空白樣品的凈化效果對(duì)比Fig.1 Comparison of purification effects of the blank sample by(a）the GB method with(b）this method

圖2 6種化合物的加標(biāo)樣品的總離子流圖(0.1 μg/kg）Fig.2 Total ion chromatograms of the six standards fortified in a blank sample at the level of 0.1 μg/kg

將標(biāo)準(zhǔn)使用液用甲醇-水(50∶50，v/v）溶液作溶劑逐級(jí)稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中均含有5 μg/L的內(nèi)標(biāo)。并采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析，記錄各化合物的色譜峰面積(A）和內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積(Ai），以A和Ai的比值y(氘代同位素內(nèi)標(biāo)除對(duì)應(yīng)各自的化合物外，其他化合物按色譜保留時(shí)間順序以相近的氘代同位素化合物為內(nèi)標(biāo)）對(duì)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液中化合物的質(zhì)量濃度x進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得出線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)(r），結(jié)果見表2。由結(jié)果可見，在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)，各物質(zhì)均取得良好線性相關(guān)，r大于0.999。質(zhì)量濃度為10.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM的提取離子色譜圖見圖3。樣品中目標(biāo)化合物的色譜峰與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰的保留時(shí)間必須一致，每種化合物的兩對(duì)離子必須同時(shí)出現(xiàn)，且豐度比符合歐盟關(guān)于食品中污染物的確認(rèn)依據(jù)2002/657/EC［25］。待測(cè)化合物的定性離子色譜峰的信噪比(S/N）應(yīng)不小于3，定量離子色譜峰的S/N應(yīng)不小于10。

表2 各化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r），LODs and LOQs of the six compounds

圖3 6種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液(含2種內(nèi)標(biāo)）的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of a standard mixture of the six compounds and two internal standards

2.4 方法的回收率和精密度

通過(guò)向陰性豬肉樣品基質(zhì)中添加分析物進(jìn)行測(cè)定，以確定方法的準(zhǔn)確度和精密度。首先精確稱取5.0 g豬肉樣品，加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得玉米赤霉醇類物質(zhì)的含量分別達(dá)到1.0、5.0、10.0 μg/kg，按優(yōu)化的條件進(jìn)行處理和測(cè)定，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表3。本方法靈敏度高，定性準(zhǔn)確，可以用于豬肉中玉米赤霉醇類藥物殘留的確證檢測(cè)。

表3 3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6）Table 3 Results of the recovery test at three spiked levels(n=6）

2.5 樣品測(cè)定

通過(guò)采用所建立的方法，對(duì)所采集的30份豬肉樣品進(jìn)行了檢測(cè)，但在采集的樣品中均未檢出上述6種玉米赤霉醇類物質(zhì)。同時(shí)進(jìn)行的作為質(zhì)量控制數(shù)據(jù)的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果也滿足測(cè)定結(jié)果的要求，回收率在70%以上。計(jì)劃再次采集大量樣品進(jìn)行檢測(cè)以確證方法的適用性。

3 結(jié)論

本文采用酶解方式對(duì)豬肉樣品進(jìn)行徹底水解，采用HLB固相萃取柱凈化，以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)6種玉米赤霉醇類物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。本方法準(zhǔn)確可靠、靈敏度度高，適用于動(dòng)物源性食品中玉米赤霉醇類物質(zhì)的多殘留確證和定量檢測(cè)。

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