體積排阻色譜法測定低分子量肝素抗凝血因子Xa的活性

張倩倩， 康經(jīng)武

(中國科學院上海有機化學研究所，上海 200032）

低分子量肝素(LMWHs）是一類抗凝血藥物，廣泛用于血栓栓塞性疾病的預防及治療［1］。其抗凝作用是通過與血液中的抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ）發(fā)生相互作用完成的。高負電荷密度的肝素能與ATⅢ上帶正電的賴氨酸結(jié)合，使ATⅢ的分子結(jié)構發(fā)生變化，暴露出活性部位的精氨酸，從而大大增加了ATⅢ與凝血因子中絲氨酸接觸的概率，可使其抗凝血活性增強1000倍左右［2］。與普通肝素相比，LMWHs增強了對凝血因子Xa(FXa）活性的抑制，但降低了對凝血酶活性的抑制，同時減少了它與內(nèi)皮細胞、巨噬細胞及其他非特異性血漿蛋白的結(jié)合，因而具有出血副作用小、生物利用率高、皮下注射吸收好、半衰期長等優(yōu)點［1，2］。

經(jīng)典的肝素活性的檢測方法是凝血實驗，如活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT）和活化凝血時間(activated clotting time，ACT）［3－5］。這些方法易受實驗室、試劑、儀器設備等條件變化的影響，并且靈敏度低，通常只能得到半定量的結(jié)果［3］。由于LMWHs能夠非常顯著地抑制FXa的活性，因此，測定LMWHs對FXa活性的抑制作用被認為是檢測LMWHs活性的黃金標準［6］。目前，最廣泛使用的測定肝素抗FXa活性的方法是底物生色法［7］。其測試原理為:LMWH與過量的ATⅢ、FXa混合，形成三元復合物LWMH·ATⅢ·FXa;形成復合物的FXa不再具有凝血活性，而剩余的未形成復合物的FXa仍能夠水解其標記有發(fā)色團(常用發(fā)色團為對硝基苯胺，pNA）的肽底物，釋放出可以被光度計定量測定的對硝基苯胺［8］。在405 nm波長下檢測到的吸光度值與樣品中LWMH的活性成反比，這樣就可以間接獲得LMWHs的活性。盡管測定抗FXa活性的分光光度測試比傳統(tǒng)的凝血測試具有更高的檢測靈敏度和準確度，但仍然存在一些缺點:分光光度法要求樣品足夠清澈透明，而ATⅢ和FXa都有紫外吸收，復雜樣品如血漿還有一定的濁度，因而在測定LMWHs活性時會引起一定的誤差;此外，分光光度法所需要的樣品量較大，尤其是ATⅢ和FXa，這些試劑價格昂貴，使得測試成本較高［9］。最近 Harris 等［9－11］發(fā)展了基于熒光分析的抗FXa測試方法，雖然可以避開樣品背景吸收的干擾，但熒光底物的背景熒光對檢測仍有較明顯的干擾。

體積排阻色譜(SEC）采用化學惰性的多孔物質(zhì)為固定相，按樣品中各個組分相對分子質(zhì)量大小實現(xiàn)分離。另外，熵驅(qū)動的SEC分離機制，最大限度地降低了分析物與固定相間的直接作用，大大簡化了分離條件，僅使用溫和的流動相和簡單的洗脫條件就可以實現(xiàn)分離［12］。目前SEC已被廣泛應用于大分子甚至是血漿蛋白的分離［12］。采用SEC色譜分離的方法排除復雜樣品基質(zhì)的干擾，就可以實現(xiàn)更準確的測量。

依諾肝素是當前使用最廣泛的一種LMWH。用本文發(fā)展的基于體積排阻色譜的方法對依諾肝素抗FXa的活性進行了測試。方法以液相色譜自動進樣器作為微量的酶反應器，依諾肝素、ATⅢ、FXa和生色底物的溶液依次進樣，在進樣器中混合、孵育，反應一段時間后，注入體積排阻色譜中進行分離檢測。自動進樣器大大減少了樣品的消耗量。將酶反應產(chǎn)生的pNA與樣品中的其他物質(zhì)分離后在其最大吸收波長(385 nm）下測定，提高了測試的靈敏度。通過方法的驗證，證明了該方法具有較好的準確性和精密度。這種基于體積排阻色譜-液相色譜的方法還可以用于血漿中依諾肝素抗FXa活性的監(jiān)測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀，配置有二元泵、紫外檢測器、柱溫箱和高性能自動進樣器;TSKgel MP(PW）-M預柱(35 mm×4.6 mm）。

ATⅢ(25 IU/支）和 FXa(71 nkat/支）購自意大利Chromogenix公司。FXa發(fā)色肽底物(chromogenic peptide substrate，CPS，序列:CH3OCO-DCHA-Gly-Arg-pNA·AcOH）、對硝基苯胺、人混合血漿購自Sigma公司。歐洲藥典LMWH標準品(美國USP公司）。兩批LMWH(依諾肝素鈉）注射液(克賽）200806和200912購自法國賽諾菲·安萬特(Sanofi Aventis）公司;供試品依諾肝素鈉(固體）20110401和20110402由杭州九源基因工程有限公司提供。

1.2 溶液配制

分別配制 0.50 mol/L Tris，1 mol/L NaCl，1 mol/L HCl和0.5 mol/L EDTA儲備液各500 mL。pH 8.4緩沖液的配制:分別量取一定量的Tris、NaCl和EDTA儲備液，用1 mol/L HCl調(diào)至pH 8.4，定容后溶液中含50 mmol/L Tris，175 mmol/L NaCl和7.5 mmol/L EDTA。pH 7.4緩沖液的配制:分別量取一定量的 Tris、NaCl，用1 mol/L HCl調(diào)至 pH 7.4，定容后溶液中含50 mmol/L Tris和150 mmol/L NaCl。FXa生色肽底物用超純水配制成3 mmol/L的儲備液，使用前用 pH 8.4緩沖液稀釋至0.5 mmol/L。

依諾肝素鈉標準品溶液(S）:按0.78的劑間比，用 pH 7.4緩沖液分別稀釋，得到 0.087 IU/mL(S1）、0.111 IU/mL(S2）、0.143 IU/mL(S3）、0.183 IU/mL(S4）的工作溶液。依諾肝素鈉供試品溶液(TA）:克賽預估效價為10000 IU/mL，按劑間比0.78，用pH 7.4緩沖液分別稀釋，得到 0.087 IU/mL(T1）、0.111 IU/mL(T2）、0.143 IU/mL(T3）、0.183 IU/mL(T4）的工作溶液;供試品溶液(TB）:杭州九源提供的依諾肝素鈉預估效價為110 IU/mg，按照劑間比0.78，用pH 7.4緩沖液配制20 mg/mL的溶液，再分別稀釋，得到 0.087 IU/mL(T1）、0.111 IU/mL(T2）、0.143 IU/mL(T3）、0.183 IU/mL(T4）的工作溶液?？鼓窤TⅢ溶液:25 mL水溶解得1 IU/mL的溶液。凝血因子FXa溶液:10 mL水溶解得7.1 nkat/mL的溶液。所有溶液由超純水配制(Millipore UV超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司），緩沖液在使用前用0.45 μm的濾膜過濾。

1.3 SEC色譜分離條件

色譜柱:TSKgel MP(PW）-M預柱(35 mm×4.6 mm），工作范圍為DNA 500～5000 bp;流動相A為H2O;流動相 B為乙腈和 50 mmol/L NaH2PO4-H3PO4混合溶液(20∶80，v/v），pH 3.0，使用前用0.45 μm的微孔過濾膜過濾。洗脫條件為:0～1 min保持100%A;1～1.5 min從100%A線性過渡到100%B;1.5～8.5 min保持100%B;8.5～9 min線性梯度回到100%A;9～13.5 min保持100%A。檢測波長385 nm;流速0.6 mL/min;柱溫25℃;進樣量 5 μL。

1.4 低分子量肝素的活性測定

將液相色譜自動進樣器作為自動的微酶反應器。LMWH、ATⅢ、FXa和底物CPS依次進樣，在進樣器內(nèi)混合孵育反應，然后用體積排阻色譜分離酶解產(chǎn)物。通過定量測定生成的pNA，實現(xiàn)LMWH活性的測定。在設定的自動進樣程序中，樣品瓶放置次序為:1#，水(清洗瓶）;2#，LMWH 樣品;3#，ATⅢ;4#，F(xiàn)Xa;5#，底物 CPS。進樣程序為:從2#和3#瓶中分別抽取1 μL，混合3次，靜置1 min;從4#瓶中抽取2 μL，混合進樣針內(nèi)的4 μL溶液3次，靜置1 min;從5#瓶中抽取5 μL，混合針內(nèi)的9 μL 溶液3次，靜置4 min;最后進樣。按照優(yōu)化的色譜分離條件分離分析產(chǎn)物。

按照已經(jīng)優(yōu)化好的方法，變換LMWH的濃度，按照 S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4的排列順序測試16次，記錄下每次反應產(chǎn)生的pNA的峰面積。以pNA的峰面積為縱坐標，LMWHs標準品(或供試品）溶液濃度的對數(shù)值為橫坐標分別做線性回歸曲線，并按照生物活性測定的統(tǒng)計方法(中國藥典2005年版第二部附錄XIV）計算效價和實驗誤差［13，14］。

1.5 血漿中低分子量肝素抗FXa活性的測定

測試血漿樣品中依諾肝素活性時未用自動進樣器。首先用pH 8.4的緩沖液分別配制0、0.1、0.2、1 IU/mL的依諾肝素鈉溶液。取20 μL某一濃度的依諾肝素鈉溶液與20 μL血漿混合，30℃水浴孵育2 min后加入40 μL FXa，混勻孵育2 min;加入40 μL CPS，混勻后置于30℃水浴孵育，計時;分別在孵育5、10、15、20、30、45、60 min 時間節(jié)點取 9 μL反應液，用6 μL 20%(體積分數(shù)）乙酸溶液淬滅酶反應;取10 μL反應液注入SEC分離，其他色譜條件與自動進樣分析相同。根據(jù)對硝基苯胺的峰面積隨時間變化曲線，并由每條曲線的斜率繪制血漿中依諾肝素的劑量反應曲線［15］。

2 結(jié)果與討論

2.1 SEC方法的建立

樣品中主要含有 ATⅢ、FXa、人血清白蛋白、LMWHs、生色底物肽CPS和pNA。ATⅢ、FXa和人血清白蛋白的相對分子質(zhì)量分別為62～67 kDa，43 kDa和67 kDa;依諾肝素鈉的平均相對分子質(zhì)量為4.5 kDa，底物CPS的相對分子質(zhì)量622.7 Da，pNA的相對分子質(zhì)量為138 Da。分離時，蛋白質(zhì)在柱內(nèi)無保留，首先洗脫出來，相對分子質(zhì)量越小的組分保留越強，洗脫時間越長，從而實現(xiàn)各組分的分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 TSKgel MP(PW）-M預柱上以150 mmol/L NaH2PO4-NaOH(pH 7.4）緩沖液作為流動相，流速為0.35 mL/min時pNA在20.2 min時可以被洗脫出來，但CPS不能被洗脫出來，這是由于堿性的精氨酸使得肽吸附在色譜柱上。將緩沖液由中性調(diào)為酸性(pH 3.0），CPS能夠較快地洗脫出來，但是卻很難洗脫出 pNA。推測由于 TSKgel MP(PW）-M柱填料的親水性差，使得疏水性的pNA吸附在填料上。為了增強緩沖液對疏水性物質(zhì)的洗脫強度，在流動相中加入一定量乙腈，同時也將流動相中鹽的濃度降為50 mmol/L。如圖1所示，當乙腈從10%增加到20%時，pNA的洗脫時間變短，柱效也大大提高?？紤]到色譜柱對有機溶劑的承受力和分離效率，我們選用了含20%ACN的50 mmol/L NaH2PO4-H3PO4(pH 3.0）作為流動相。

圖1 流動相中有機溶劑濃度對pNA洗脫時間的影響Fig.1 Effect of organic composition in mobile phase on the elution time of pNA

盡管上述色譜條件可以滿足分離度和效率的要求，但pH 3.0的酸性緩沖液和乙腈都有可能引起蛋白的沉淀，所以采用兩種流動相接力洗脫的方式。流動相A為50 mmol/L NaH2PO4-H3PO4緩沖液(pH 7.4）;流動相B為含20%ACN的50 mmol/L NaH2PO4-H3PO4緩沖液(pH 3.0）。先用流動相A將蛋白等大分子洗脫出柱，再用流動相B將CPS和pNA洗脫出來。但兩種pH值差異較大的洗脫液交替洗脫時產(chǎn)生大量的氣泡，分離效果差。所以將流動相A改為純水，避免了氣泡的產(chǎn)生。最終選擇1.3節(jié)所述色譜洗脫條件。

在經(jīng)過優(yōu)化的洗脫條件下，血漿樣品中的蛋白、CPS、pNA被分離開，結(jié)果如圖2所示。傳統(tǒng)的分光光度法中，為了避免發(fā)色肽底物的干擾，只能選擇在405 nm的波長下檢測，降低了檢測的靈敏度［8］。而在我們的方法中，由于pNA能與酶反應液中其他成分分開，因此可以在其最大吸收波長385 nm下檢測，獲得最佳的檢測靈敏度。如圖2所示，考察了不同檢測波長下對硝基苯胺的峰面積，在385 nm下得到的峰面積(1288）比在405 nm下得到的峰面積(895）高40%。

2.2 方法驗證

圖2 不同吸收波長下標準品混合物分離的色譜圖Fig.2 Chromatograms obtained at different detection wavelengths

在優(yōu)化的色譜條件下考察了方法的重復性。pNA的洗脫時間和峰面積在日內(nèi)和日間的重復性列于表1中，該方法日間和日內(nèi)重復性的RSD均小于1%，具有優(yōu)良的方法重現(xiàn)性。

表1 對硝基苯胺的洗脫時間和峰面積在日內(nèi)與日間的重復性Table 1 Intraday and interday repeatabilities in terms of the retention time and peak area of pNA

隨后，我們對pNA的濃度與峰面積關系的線性范圍進行了考察，在0.05～1 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，r2為0.9998，線性關系良好。

2.3 LMHWs抗FXa的活性測定

2.3.1 在線酶反應條件的選擇

首先考察了酶FXa在測試過程中的穩(wěn)定性。將FXa從4℃冰箱中取出，室溫下至少放置20 min后恢復活力［15］，用自動進樣器取 FXa溶液2 μL和CPS溶液5 μL混合3次，靜置4 min后進樣分離。酶活性隨測試時間變化的趨勢如圖3所示。

圖3 室溫下FXa活性隨測試時間變化趨勢圖Fig.3 Time course of the FXa activity at room temperature

從圖3中可以看出，F(xiàn)Xa在室溫下放置200 min以內(nèi)，其活性基本保持不變，實驗前后10個點的RSD為2.1%。200 min之后，酶活性衰減明顯。隨后考察了酶ATⅢ在室溫下的穩(wěn)定性，測試時先抽取1 μL的依諾肝素鈉溶液和1 μL的ATⅢ溶液，混合后靜置1 min，再抽取2 μL FXa混合并靜置1 min，最后抽取5 μL CPS混合后靜置4 min，進樣分離。發(fā)現(xiàn)在室溫下放置40 min的FXa活力保持不變，再延長放置時間，其活力會明顯衰減。因此在進行肝素活性測試時每分析8次后，更換一次 FXa，每次使用前在室溫下放置20 min恢復活力。ATⅢ每次分析更換一次，每次使用前在室溫下放置20 min恢復酶活力。

2.3.2 LMWHs抗 FXa 的效價測定

將依諾肝素鈉標準品按照1∶0.78的劑間比配制一組梯度效價溶液(即 S1、S2、S3、S4）。對于供試品依諾肝素鈉，首先預估一個效價，再根據(jù)預估效價配制出與標準品效價濃度相同的梯度溶液，分別標記為T1、T2、T3、T4。由于使用的是分離分析的方法，不需要扣除空白，所以省去了空白對照組。

用已經(jīng)優(yōu)化好的方法，按照以下順序:S1、S2、S3、S4，T1、T2、T3、T4，T1、T2、T3、T4，S1、S2、S3、S4測試16次，記錄下每次反應中 pNA的峰面積。以pNA的峰面積為縱坐標，標準品(或供試品）效價濃度的對數(shù)值為橫坐標分別做線性回歸曲線，并按照中國藥典2005年版第二部附錄XIV中生物檢定統(tǒng)計方法計算效價和實驗誤差，平均可信限率(FL）不得大于15%，劑間、回歸需顯著，偏離平行、二次曲線、反向二次曲線需不顯著。

測試了克賽的兩批依諾肝素鈉試劑，以及由杭州九源公司提供的依諾肝素鈉。以標準品(或供試品）溶液濃度的對數(shù)值為橫坐標的線性回歸曲線都表現(xiàn)出良好的線性和雙平行線性質(zhì)(見圖4）。實驗數(shù)據(jù)用4×4量平行統(tǒng)計方法進行了統(tǒng)計(見表2）。

圖4 供試品和標準品的峰面積與濃度對數(shù)值的線性回歸曲線Fig.4 Regression curves of the peak areas against the log concentrations of the test samples and a standard sample Lot No.:a.200806;b.200912;c.20110401;d.20110402.

本實驗測得的結(jié)果與標示值結(jié)果接近，F(xiàn)L小于15%，可靠性檢測全部通過，劑間、回歸顯著，偏離平行、二次曲線、反向二次曲線不顯著。基于SEC測得的4批依諾肝素鈉的效價與它們由分光光度法測定的標示效價一致。

表2 實驗測得樣品效價Table 2 Determined potency of enoxaparin

2.4 血漿中低分子量肝素抗FXa活性研究

依諾肝素具有較好的藥物動力學可預測性，因此對絕大部分病人而言不需要進行血藥濃度的監(jiān)測。然而，對于一些特殊的受藥群體，如肥胖病患者、腎功能缺陷患者、孕婦、老人、兒童等，由于他們藥代動力學的改變，國際血栓和止血協(xié)會(International Society of Thrombosis and Haemostasis）建議對依諾肝素的血藥濃度進行監(jiān)測［16，17］。本文考察了血漿中依諾肝素在0～1 IU/mL范圍內(nèi)抗FXa活性的動力學變化。圖5a為pNA紫外吸收強度隨時間變化的曲線。當依諾肝素為0時，只需反應5 min紫外吸光度值便可達1000 mAU以上;當依諾肝素超過0.1 IU/mL時，紫外吸收強度隨反應時間的增加緩慢增加。劑量反應曲線是由紫外吸光強度曲線的線性區(qū)域計算出的斜率(反應速率）與劑量關系的曲線(圖5b）。劑量反應曲線中，反應速率隨著LWMH的增加而減小。當血漿中依諾肝素超過0.2 IU/mL時斜率值變化很小，即抗凝血效果顯著。通過測定血液中依諾肝素的抗凝血活性，由圖5b即可反推出依諾肝素在血液中的濃度。

3 結(jié)論

本文發(fā)展了一種基于SEC測試低分子量肝素抗FXa活性的方法，為低分子量肝素效價的測定提供了一個簡單、高效、自動化的方法，有助于低分子量肝素生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。在自動進樣器上完成溶液的混合、反應，大大簡化了手工操作程序。只需使用一根長30 mm的體積排阻色譜柱即可實現(xiàn)復雜酶反應液中的生色底物、游離發(fā)色團和各種蛋白的分離。因此對游離發(fā)色團的定量不再受血漿中其他成分的干擾，拓展了樣品的應用范圍。同時也可以在對硝基苯胺的最大吸收波長下檢測而不用擔心受到底物在此波長下的吸收干擾。并且該方法極大地減少了樣品的消耗量，大大地降低了成本。因此有可能用于各種復雜樣品中依諾肝素抗FXa活性的監(jiān)測，對肝素臨床治療和療效評價有著重要的意義。

圖5 SEC測量的抗FXa活性的動力學變化曲線Fig.5 Pharmacokinetic profiles of SEC-based anti-FXa assay in the presence of enoxaparin(0－1 IU/mL）

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