高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定保健食品中的23種精神藥品

朱 琳， 阮麗萍， 劉華良， 吉文亮， 馬永建，*

(1.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京 210009;2.江蘇省疾病預(yù)防與控制中心，江蘇南京 210009）

慢性失眠一直是困擾各國(guó)民眾的常見(jiàn)病、多發(fā)?。?］。精神藥品包括苯二氮類、巴比妥類、非苯二氮類抗焦慮劑［2］，常用于治療失眠、焦慮等臨床疾病;但這類藥物副作用大，且治標(biāo)不治本，需長(zhǎng)期服用，易產(chǎn)生依賴性。某些生產(chǎn)廠家利用保健品成分復(fù)雜、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善等監(jiān)管空缺，在保健品中非法添加精神藥品以提高其產(chǎn)品的療效，欺騙消費(fèi)者。建立保健品中非法添加精神藥品的快速檢測(cè)方法對(duì)防止和打擊此類不法行為，保障人民健康具有極為重要的意義。

精神藥品的濫用一直是全球關(guān)注的重點(diǎn)之一。各類基質(zhì)中多種微量精神藥品的檢測(cè)均有報(bào)道，包括血液［3］、尿液［4］、頭發(fā)和指甲［5］、唾液［6］、奶制品［7］、動(dòng)物組織［8］、中成藥及保健品［9，10］等。檢測(cè)方法有薄層色譜法［11］、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA）［12］、HPLC 法［13，14］、GC 法［15，16］、GC-MS法［17］、HPLC-MS/MS 法［18，19］和 UPLC-Q-TOF-MS法［20］等。保健食品中通常含有多種中藥材，基質(zhì)復(fù)雜多樣，薄層掃描法、ELISA和HPLC法在定性時(shí)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，已經(jīng)不適用于保健食品中精神藥品分析的要求。GC和GC-MS對(duì)部分藥物的分析需要進(jìn)行衍生化，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)。HPLC-MS/MS法靈敏度高，選擇性和特異性好，在多組分微量成分的分析上顯示出了極大的優(yōu)越性，被越來(lái)越多地用于保健食品中非法添加化學(xué)藥物的研究。目前已報(bào)道的檢測(cè)方法多為同時(shí)檢測(cè)幾種［7-10］或十余種［3-6］精神藥品，而且多為早期臨床上使用的鎮(zhèn)靜安神類藥物。隨著醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展，更多的化學(xué)藥物用于失眠癥的治療［21，22］。生產(chǎn)企業(yè)也會(huì)選擇尚未被監(jiān)測(cè)的活性成分添加。建立專屬性強(qiáng)、靈敏度高、定性和定量準(zhǔn)確、能同時(shí)檢測(cè)數(shù)十種精神藥品的分析方法勢(shì)在必行。本研究收集了臨床上具有鎮(zhèn)定安神效果的23種化學(xué)藥物，建立了可以對(duì)其同時(shí)檢測(cè)和確證的HPLC-MS/MS法，為保健食品中違禁精神藥品的監(jiān)督提供了有力的工具。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACCELA高效液相色譜儀、TSQ Quantum Access Max三重四極桿質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源，美國(guó)Thermo Fisher公司生產(chǎn)）;D-78224超聲波清洗機(jī)(德國(guó)Elma公司生產(chǎn)）;Sigma 1-14離心機(jī)(德國(guó)賽多利斯公司）;甲醇、乙腈和甲酸銨均為色譜純(迪馬公司）;實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水系統(tǒng)(Millipore公司）制備。標(biāo)示具有改善睡眠功能的保健食品樣品購(gòu)自本地超市及本實(shí)驗(yàn)室檢品。

23種精神藥品標(biāo)準(zhǔn)品:阿普唑侖(alprazolam）、異戊巴比妥(amobarbital）、氯硝安定(clonazepam）、氯氮卓(chlordiazepoxide）、安定(diazepam）、艾司唑侖(estazolam）、勞拉西泮(lozazepam）、安寧(meprobamate）、安眠酮(methaqualone）、咪唑安定(midazolam）、硝基安定(nitrazepam）、去甲安定(nordiazepam）、奧沙西泮(oxazepan）、苯巴比妥(phenobarbital）、三唑侖(trizolam）、扎來(lái)普隆(zaleplon）(1 mg/mL甲醇溶液，美國(guó)Cerilliant公司）;阿扎哌隆(azaperone）和氯丙嗪(chlorpromazine）(德國(guó) Dr.Ehrenstorfer實(shí)驗(yàn)室）;巴比妥(barbital）和氯氮平(clozapine）(中國(guó)食品藥品檢定研究院）;氟哌啶醇(haloperidol）、奮乃靜(perphenazine）和賽拉嗪(xylazine）(Sigma公司）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱取一定量的固體標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇為溶劑，分別制備質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。購(gòu)于Cerilliant公司的上述對(duì)照品甲醇溶液亦作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。于-20℃冰箱中保存。

分別精密量取上述23種對(duì)照品溶液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得含巴比妥、苯巴比妥和異戊巴比妥均為100 mg/L，含安眠酮、氟哌啶醇、阿扎哌隆、咪唑安定、氯氮平和奮乃靜均為2 mg/L，含其他14種對(duì)照品均為10 mg/L的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2 樣品處理

取供試品(片劑，取數(shù)片，研細(xì);膠囊劑，取數(shù)粒，傾取內(nèi)容物，研細(xì)），準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品于10 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲提取20 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。于12000 r/min離心5 min，上清液用于HPLC-MS/MS測(cè)定。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

色譜條件:色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱(100 mm × 2.1 mm，3.5 μm）。流動(dòng)相 A 為 10 mmol/L甲酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈-甲醇(1∶1，v/v）溶液。梯度洗脫程序:0～2 min，12%B;2～6 min，12%B～50%B;6～12 min，50%B;12～17 min，50%B～100%B;17～18 min，100%B～12%B;18 ～23 min，12%B。流速0.3 mL/min，柱溫 30℃，進(jìn)樣體積 10 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧電離正離子模式(ESI+）和負(fù)離子模式(ESI-）切換;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM）;噴霧電壓:+3.0 kV 或 -2.5 kV;輔助氣(N2）流量:3.0 L/min;鞘氣(N2）流量:12 L/min;碰撞氣(Ar）壓力:0.200 Pa(1.5 mTor）;毛細(xì)管溫度:350 ℃;氣化溫度:400℃。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 23種精神藥品在MRM模式下檢測(cè)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for the 23 sedative drugs in MRM mode

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

2.1.1 HPLC-MS/MS 條件優(yōu)化

首先利用流動(dòng)注射的方式對(duì)各種待測(cè)化合物的管透鏡電壓和碰撞能量進(jìn)行了優(yōu)化，得到的各物質(zhì)的特征離子和碰撞能量如表1所示。23種化合物的母離子均為準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+或［MH］-;2種電離方式可以同時(shí)檢測(cè)。

為了獲得良好的分離效果和離子化效率，本實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化。分別比較了甲醇和乙腈作為有機(jī)相，水、乙酸銨和甲酸銨作為水相的分離效果。結(jié)果將甲醇和乙腈按1∶1的體積比混合作為有機(jī)相的分離效果最好;水相中加入緩沖鹽，多個(gè)化合物的拖尾峰形得到明顯的改善，響應(yīng)值增大;甲酸銨與乙酸銨相比，能使保留時(shí)間短的化合物出峰時(shí)間延長(zhǎng)，減少了基質(zhì)的干擾。最終將流動(dòng)相確定為甲醇-乙腈(1∶1，v/v）為有機(jī)相，10 mmol/L 甲酸銨溶液作水相，梯度洗脫分離。

優(yōu)化條件下23種精神藥品標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 23種精神藥品標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM譜圖Fig.1 Chromatograms of a mixed standard solution of the 23 sedative drugs in MRM mode

2.1.2 提取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)中23種目標(biāo)化合物于甲醇中均有較好的溶解度，故選擇不同濃度的甲醇水溶液作提取溶劑，比較其提取效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇濃度越低，提取液的顏色越深，水溶性雜質(zhì)越多。對(duì)于大多數(shù)保健品，以100%甲醇提取時(shí)，高速離心后的提取液比較潔凈，無(wú)需進(jìn)一步凈化，簡(jiǎn)化了樣品前處理過(guò)程，最終確定以甲醇為提取液。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)效應(yīng)

為了比較樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物質(zhì)譜響應(yīng)的影響，以陰性口服液和陰性膠囊樣品制作空白基質(zhì)溶液，分別添加相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品制備空白基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別以各分析物的峰面積(Y）和對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(X，μg/L）進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。巴比妥、異戊巴比妥、苯巴比妥的線性范圍為 0.1 ～10 μg/L，安眠酮、咪唑安定、氯硝安定、阿扎哌隆、氟哌啶醇、奮乃靜的線性范圍為0.002 ～0.2 μg/L，其他 14 種化合物的線性范圍為0.01～1 μg/L。在線性范圍內(nèi)，各分析物均有良好的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)R2均不小于0.990）?？诜汉湍z囊樣品基質(zhì)使得某些目標(biāo)化合物質(zhì)譜信號(hào)增加或減少，如賽拉嗪、安眠酮、硝基安定、扎來(lái)普隆、氯硝安定、氯氮平、阿扎哌隆等，但其斜率變化均在標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的±20%范圍內(nèi)，因而可忽略基質(zhì)效應(yīng)［23，24］。

2.2.2 檢出限與定量限

取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇倍比稀釋后測(cè)定，以信噪比約為3時(shí)對(duì)應(yīng)的各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為檢出限;以信噪比約為10時(shí)對(duì)應(yīng)的各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為定量限。各目標(biāo)藥物的檢出限和定量限結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.3 加標(biāo)回收率和精密度

以不含目標(biāo)化合物的口服液和膠囊保健品為本底，分別在3個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定。巴比妥、苯巴比妥和異戊巴比妥的3個(gè)加標(biāo)水平分別為0.1、1和10 mg/L;安眠酮、氟哌啶醇、阿扎哌隆、咪唑安定、氯氮平和奮乃靜6種化合物分別為0.002、0.02 和 0.2 mg/L;其他 14 種化合物分別為0.01、0.1 和1 mg/L;平行測(cè)定 6 次，以評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確度。所得到的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD）見(jiàn)表2。所得結(jié)果均符合食品理化檢測(cè)要求［25］。

表2 23種精神藥品的檢出限、定量限及其在空白口服液和膠囊保健品中的加標(biāo)回收率和精密度Table 2 Limits of detection(LODs），limits of quantification(LOQs）and recoveries and relative standard deviations(RSD）spiked in blank oral liquid and capsule samples at three spiked levels of the 23 sedative drugs

2.3 樣品測(cè)定

分別按1.2節(jié)的方法處理13種樣品，依法測(cè)定。結(jié)果表明，13種保健品中有一種添加了安寧(207 μg/kg），一種添加了奧沙西泮(5.1 mg/kg），2種添加了扎來(lái)普隆(分別為53和511 μg/kg）。

3 結(jié)論

本文建立了HPLC-MS/MS檢測(cè)保健品食品中非法添加23種鎮(zhèn)靜安神類化學(xué)藥品的方法。從實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，本方法準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，適用于保健品中非法添加多種精神藥品的確證定量檢測(cè)，為控制保健品質(zhì)量、打擊保健品行業(yè)非法添加行為提供有效依據(jù)。

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