液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜和超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜用于檢測牛肉中的剛果紅★

林 慧，徐春祥，顏春榮，張 征，王歲樓

（1.江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，江蘇 南京 210007；2.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009）

剛果紅，化學(xué)名為3，3′-［（1，1′-聯(lián)苯）-4，4′-雙偶氮］雙（4-氨基萘-1-磺酸）二鈉，分子式為C32H22N6Na2O6S2，C.I.22120，結(jié)構(gòu)式見圖1。又名直接紅28、直接大紅、棉紅、直接朱紅，屬于聯(lián)苯胺為母體的紅色偶氮染料。剛果紅是水溶性染料，易溶于乙醇［1］，與纖維素纖維間有極強(qiáng)的吸附力。目前一般用于臨床診斷淀粉樣病變、作為生物染色劑及酸堿指示劑等［2］。水溶液中的剛果紅可被光催化降解［3-5］。剛果紅可與機(jī)體蛋白結(jié)合，為可疑致癌物與誘變劑。被人體吸收后，在人體的正常代謝生化反應(yīng)條件下，可能發(fā)生還原反應(yīng)使偶氮基斷裂，重新生成致癌芳香胺，并經(jīng)過活化作用改變?nèi)梭wDNA的結(jié)構(gòu)與功能，引起病變和誘發(fā)癌癥［6-8］?；趧偣t的毒性作用，紡織業(yè)禁用剛果紅已久，同時它也被很多國家列為食品中禁用著色劑。但是，在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，有不法商家在加工熟牛肉制品的過程中使用剛果紅著色，以改善熟牛肉制品的感官色澤，提高銷售量。因此，有必要對熟牛肉制品中的剛果紅進(jìn)行檢測。

圖1 剛果紅結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of congo red

目前報道的剛果紅測定方法主要有分光光度法［9］、高效液相色譜-串聯(lián)單四極桿質(zhì)譜法［10，11］、高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法［12］，大部分是針對環(huán)境中剛果紅的測定。關(guān)于食品，目前僅檢索到凌睿等［12］報道的運用高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜測定肉制品中的剛果紅。但是，其檢出限較高，不適用于微量剛果紅的分析，且三重四極桿質(zhì)譜的質(zhì)量分辨率遠(yuǎn)低于飛行時間質(zhì)譜，易發(fā)生假陽性事件。四極桿飛行時間質(zhì)譜具有優(yōu)異的精確度、靈敏度和掃描速度，并有配套的數(shù)據(jù)分析軟件，可以對復(fù)雜樣品進(jìn)行鑒別分析、定量分析、譜圖檢索等。通過建立待測化合物標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜的譜圖數(shù)據(jù)庫與樣品的高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜分析得到的質(zhì)譜信息比對檢索，可以有效降低食品樣品中其他組分對測定結(jié)果的干擾，從而實現(xiàn)對食品樣品中有害物質(zhì)的篩查［13，14］。

近幾年食品安全事件頻發(fā)，商家為了追求利益最大化，違法添加違禁添加劑，對人民的生命財產(chǎn)造成了嚴(yán)重危害。本文探討了食品中非法添加剛果紅的鑒別和定量方法，采用高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜（LC-QTOF MS）首先鑒別未知物，確定其具體成分后，對其采用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-MS／MS）進(jìn)行定量。以期為牛肉及其他肉制品中非法添加剛果紅的鑒別、定量提供良好的解決方案。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

1200RRLC型高效液相色譜-串聯(lián)6530型四極桿飛行時間質(zhì)譜儀，MassHunter色譜工作站及PCDL軟件自建有著色劑質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)庫（美國Agilent公司）；1290型超高壓液相色譜-串聯(lián)API 4000＋三重四極桿質(zhì)譜儀，Analyst軟件（美國AB SCIEX公司）；XW-80A漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；Avanti J-E型離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特公司）；5418R型離心機(jī)（艾本德中國有限公司）；XS-205DU型電子分析天平（美國梅特勒-托利多公司）；FW100型高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

剛果紅標(biāo)準(zhǔn)品（CAS 573-58-0）購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。甲醇、正己烷均為色譜純，購自德國Merck公司。實驗室用水為超純水，由美國Millipore公司純水儀制得。

牛肉樣品為市售熟牛肉樣品。

1.2 實驗步驟

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和工作溶液的配制

精確稱取剛果紅標(biāo)準(zhǔn)品適量置于10mL容量瓶中，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1.0g／L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

分別吸取不同體積的剛果紅標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇逐級稀釋成質(zhì)量濃度為0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.5、1mg／L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品制備

稱取5g均勻搗碎的熟牛肉樣品（精確至0.01 g）于50mL聚四氟乙烯具塞離心管中；準(zhǔn)確加入10 mL甲醇和10mL正己烷，渦旋5min；放入離心機(jī)中，以5000r／min的轉(zhuǎn)速離心5min；取上清液2 mL移入2.5mL離心管中，放入高速離心機(jī)中，以12000r／min的轉(zhuǎn)速離心2min。移取上清液于進(jìn)樣小瓶中，必要時適當(dāng)用甲醇稀釋。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18Rapid Resolution HD（50mm×2.1mm，1.8μm），定性分析時用兩通管代替色譜柱；流動相:甲醇-水（95∶5，v／v）；流速:0.2mL／min；柱溫:30 ℃；進(jìn)樣量:LCQTOF MS為5μL，UPLC-MS／MS為2μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

定性條件:Agilent 6530型四極桿飛行時間質(zhì)譜儀采用電噴霧離子化（ESI）源，負(fù)離子模式；噴嘴電壓為1000V，毛細(xì)管電壓為3500V，碰撞電壓為130V，錐孔電壓為65V；干燥氣溫度為350℃；干燥氣流速為5L／min；霧化器壓力為310kPa；鞘氣溫度為350℃；鞘氣流速為11L／min。一級質(zhì)譜為單級質(zhì)譜采集模式，采集范圍為m／z 100～700；采集速度為2spectra／s。二級碎片離子的質(zhì)譜采集模式為目標(biāo)離子采集模式，采集范圍為m／z 100～700；采集速度為 2spectra／s；碰撞 能 為 40、50、60V。

定量條件:API 4000＋型三重四極桿質(zhì)譜儀采用ESI源，負(fù)離子模式；碰撞氣（CAD）壓力55kPa，氣簾氣（CUR）壓力280kPa，霧化氣（GS1）壓力345 kPa，輔助加熱氣（GS2）壓力345kPa；離子噴霧電壓-4500V；毛細(xì)管溫度（TEM）500℃；優(yōu)化的各離子對質(zhì)譜參數(shù)值見表1。

表1 質(zhì)譜優(yōu)化離子對參數(shù)Table 1 Parameters optimized with the developed method by UPLC-MS／MS

1.4 著色劑質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫

采用Agilent公司的個人化合物數(shù)據(jù)庫工作站（Personal Compound Database and Library，PCDL）建立包括剛果紅在內(nèi)的102種禁用和限用著色劑的精確分子質(zhì)量及QTOF質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性方法的建立與優(yōu)化

未知物的定性鑒別是通過與預(yù)先建好的質(zhì)譜圖庫進(jìn)行檢索匹配實現(xiàn)的。按照1.2.2節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，按照1.3節(jié)定性條件上機(jī)分析。在單級質(zhì)譜采集模式下采集一級質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)（見圖2）后進(jìn)行分子特征提取，將提取出的精確質(zhì)量數(shù)導(dǎo)入到PCDL軟件中，與質(zhì)譜圖庫中的化合物進(jìn)行檢索匹配，發(fā)現(xiàn)與質(zhì)譜圖庫中的剛果紅匹配度較高。然后，在目標(biāo)離子采集模式獲取二級質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)（見圖3），導(dǎo)入到PCDL軟件中進(jìn)行二級質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)檢索匹配，發(fā)現(xiàn)與質(zhì)譜圖庫中的剛果紅二級質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)匹配度較高，分值達(dá)到97%以上。因此確認(rèn)該未知物為剛果紅。

圖2 （a）剛果紅和（b）未知物的一級質(zhì)譜圖Fig.2 MS spectra of（a）congo red and（b）the unknown substance

試驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)分別用水、甲醇、乙腈配制剛果紅標(biāo)準(zhǔn)溶液時，剛果紅在水和甲醇中的溶解度較好，在乙腈中的溶解度較差。為了得到較好的離子化效果，選擇采用甲醇配制剛果紅標(biāo)準(zhǔn)溶液。同時，由于剛果紅結(jié)構(gòu)特殊，其吸附能力較強(qiáng)且在超聲波中易降解，所以在樣品前處理時采用渦旋提取-高速離心方式凈化，而避免采用超聲提取-膜過濾方式凈化。

圖3 （a）剛果紅、（b）未知物和（c）未知干擾物在不同碰撞能下的二級質(zhì)譜圖Fig.3 MS／MS spectra of（a）congo red，（b）the unknown substance and（c）the unknown interfering substance with different collision energies

進(jìn)行定性試驗分析時，在空白溶劑中發(fā)現(xiàn)了與剛果紅母離子精確質(zhì)量數(shù)（m／z 325.0537）相近的一個質(zhì)量數(shù)（m／z 325.1877）。這兩個精確質(zhì)量數(shù)在四極桿飛行時間質(zhì)譜中可以分辨，但是在相對低靈敏度的三重四極桿質(zhì)譜中難以分辨，因此試驗中對此未知干擾物進(jìn)行了二級質(zhì)譜確證，圖3為剛果紅和未知干擾物的二級質(zhì)譜碎片信息。剛果紅母離子（m／z 325.0537）的子離子為 m／z 234.0103、169.0404、152.0378、80.9553；未知干擾物母離子（m／z 325.1830）的 子 離 子 為 m／z 281.2457、197.0267、183.0110、119.0496、79.9577。同時，二者在色譜保留時間上沒有區(qū)別，因此在采用三重四極桿質(zhì)譜儀定量分析時要避免采用未知物的子離子作為定量離子對。

2.2 定量方法的建立與優(yōu)化

色譜條件優(yōu)化時，考察了不同流動相體系下剛果紅的響應(yīng)。當(dāng)流動相中水相比例增大時，剛果紅響應(yīng)變差，這可能與剛果紅的較強(qiáng)吸附能力有關(guān)。采用超高壓液相色譜分離，剛果紅的保留時間增加不明顯，這是因為超高壓液相色譜采用填充了細(xì)粒徑微球填料的色譜柱進(jìn)行分離。色譜柱填料是影響液相色譜系統(tǒng)分離能力的關(guān)鍵因素之一，在相同線速度下，填料粒徑越小，理論塔板高度越小，柱效越高。通常情況下，超高壓液相色譜的出峰時間為普通高效液相色譜出峰時間的1／10。因此，一方面因為超高壓液相色譜縮短了出峰時間，另一方面因為剛果紅極性較強(qiáng)極易洗脫所以調(diào)整流動相比例并沒有能夠明顯增加其保留時間。最終選擇了使剛果紅響應(yīng)強(qiáng)度較高的95%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇作為流動相以保證良好的離子化響應(yīng)。在此條件下，剛果紅的保留時間為1.38min。

質(zhì)譜條件優(yōu)化時，根據(jù)剛果紅結(jié)構(gòu)中含有磺酸結(jié)構(gòu)，選擇了負(fù)離子模式下進(jìn)行監(jiān)測。在采用流動注射方式優(yōu)化剛果紅的母離子時，發(fā)現(xiàn)剛果紅母離子［M-2Na＋H］-（m／z 651.1）和［M-2Na］2-（m／z325.0）均有響應(yīng)。其中m／z 325.0的響應(yīng)較強(qiáng)，因此選擇其為母離子。優(yōu)化的去簇電壓（DP）為-95V、入口電壓（EP）為-10V。然后給予其一定碰撞能優(yōu)化子離子，發(fā)現(xiàn)在不同碰撞能下m／z 325.0的母離子有5個子離子（m／z 416.0、182.7、152.0、118.9、81.0）有較強(qiáng)響應(yīng)。而從上述2.1節(jié)四極桿飛行時間質(zhì)譜定性分析結(jié)果可知，m／z 182.7和118.9為未知干擾物子離子。因此選擇m／z152.0和416.0作為母離子m／z325.0的監(jiān)測子離子，并對2個子離子進(jìn)行了碰撞電壓（CE）和出口電壓（CXP）的優(yōu)化。確定最終的MRM檢測離子為 m／z 325.0→m／z 152.0，m／z 325.0→m／z 416.0。在最終優(yōu)化的定量條件下得到剛果紅標(biāo)準(zhǔn)品和實際樣品的提取離子流圖（見圖4和圖5）。

2.3 定量方法的驗證

2.3.1 檢出限和定量限

圖4 剛果紅標(biāo)準(zhǔn)品的（a）定量離子和（b）定性離子的提取離子流圖Fig.4 Extracted ion chromatograms of（a）the quantitative ion and （b）the confirmation ion of congo standard

圖5 實際樣品的（a）定量離子和（b）定性離子的提取離子流圖Fig.5 Extracted ion chromatograms of（a）the quantitative ion and （b）the confirmation ion of the real sample

以S／N＝3（噪聲以進(jìn)樣量2μL時的基線計算），剛果紅標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢出限約為0.01mg／L。以S／N＝10（噪聲以進(jìn)樣量2μL時的基線計算），剛果紅標(biāo)準(zhǔn)溶液的定量限約為0.03mg／L。熟牛肉制品中剛 果 紅 的 檢 出 限 為 0.02mg／kg，定 量 限 為0.06mg／kg。

2.3.2 工作曲線和線性范圍

分別吸取1.2.1節(jié)中配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照1.3節(jié)定量實驗條件上機(jī)測定，以峰面積Y對剛果紅質(zhì)量濃度X （mg／L）計算線性回歸方程。在0.03～1mg／L線性范圍內(nèi)，線性回歸方程為Y＝2640.6 X-7372.2，線性相關(guān)系數(shù)為0.9998。

2.3.3 精密度

分別取0.05、0.1和0.5mg／L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積計算精密度，峰面積的RSD介于2.77%～4.65%之間，表明儀器精密度良好。

2.3.4 回收率

取空白牛肉9份，在0.06、0.2、1mg／kg 3個加標(biāo)水平上進(jìn)行回收率試驗，結(jié)果見表2?？梢钥闯?個加標(biāo)水平的回收率達(dá)到88%～91%，RSD為2.20%～3.77%，表明該方法回收率較高且穩(wěn)定。

表2 空白牛肉樣品中剛果紅的加標(biāo)回收率（n＝3）Table 2 Recoveries of congo red spiked in a blank beef sample（n＝3）

2.4 牛肉樣品中剛果紅含量的測定

利用本方法對某市售牛肉作坊中的一個熟牛肉樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該熟牛肉中剛果紅的含量達(dá)到6.32mg／kg，RSD為3.78%。

3 結(jié)論

采用液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜分析結(jié)合譜圖庫檢索，確定未知添加物為剛果紅后，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜快速檢測牛肉中剛果紅的方法。實驗結(jié)果表明，該方法具有簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度好的優(yōu)點。其思路可以為食品中非法添加物的鑒別和定量、食品質(zhì)量控制和安全評價提供參考。

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