固相萃取-超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)尿樣中的麻黃堿和N-甲基麻黃堿

張 琳，張福成，王朝虹，蔣 曄＊，許 萌，李 虹

（1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北 石家莊 050017；2.空軍總醫(yī)院，北京 100142；

3.最高人民檢察院司法鑒定中心，北京 100040；4.云南省公安廳刑警總隊(duì)，云南 昆明 650000）

麻黃堿和N-甲基麻黃堿具有擴(kuò)張支氣管、抗過(guò) 敏和鎮(zhèn)咳作用，是感冒藥中的常見成分。其中，麻黃堿具有較強(qiáng)的興奮作用［1］，是國(guó)際奧委會(huì)嚴(yán)格禁止的興奮劑。因此，體育賽事前確定運(yùn)動(dòng)員是否攝取該類藥物時(shí)，常需進(jìn)行尿樣等生物檢材的檢測(cè)。對(duì)于具有器質(zhì)性心臟病的人員，服用含麻黃堿的制劑還可引起意外心律紊亂而致死。此外，二者還是制造苯丙胺類毒品的主要原料，從吸毒人員體內(nèi)采集的血樣、尿樣及毛發(fā)等生物檢材中檢測(cè)該類物質(zhì)是刑偵機(jī)構(gòu)立案的重要依據(jù)。因此，建立快速、靈敏的生物樣品中痕量麻黃堿分析方法，可大大延長(zhǎng)生物檢材的檢測(cè)周期，用于追溯特殊人群的用藥史，對(duì)于藥物的安全使用具有重要意義。

生物檢材成分復(fù)雜而待測(cè)物含量往往較低，因此常需對(duì)生物樣品中的待測(cè)物進(jìn)行提取、純化和富集，以提高檢測(cè)靈敏度。已報(bào)道的生物樣品前處理方法有稀釋法［2］、蛋白沉淀法［3］、液相萃取法［4-11］、中空纖維液相微萃取法［12］、衍生化法［13-15］、超濾法［16］等。但這些方法均存在一些缺點(diǎn):稀釋法嚴(yán)重污染色譜系統(tǒng)；蛋白沉淀法會(huì)導(dǎo)致樣品稀釋，檢測(cè)靈敏度降低；液相萃取操作繁瑣；衍生化法往往受到衍生化效率的限制；中空纖維微液相萃取法的重現(xiàn)性較差；而超濾法存在濃差極化現(xiàn)象，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果失真。此外，文獻(xiàn)［17-19］報(bào)道了用固相萃取-液相色譜-質(zhì)聯(lián)用的方法檢測(cè)生物樣品中的麻黃堿，檢測(cè)靈敏度為0.1～1μg／L，對(duì)未及時(shí)取樣且濃度極低的樣品往往無(wú)法獲得滿意的分析結(jié)果。因此，本文建立了固相萃取-超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（SPE-UPLC-ESI MS／MS）聯(lián)用技術(shù)同時(shí)定量測(cè)定尿樣中的痕量麻黃堿和N-甲基麻黃堿。該方法能有效提取、純化和富集待測(cè)物，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC超高相液相色譜儀，Xevo TQ-MS串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀和MasslynxTM工作站（美國(guó)Waters公司）。Milli-Q超純水制造系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；固相萃取儀（美國(guó) Waters公司），Oasis HLB和Oasis MCX固相萃取柱（1mL，30mg；美國(guó) Waters公司）。

鹽酸麻黃堿（批號(hào):171241- 200404）和鹽酸甲基麻黃堿（批號(hào):171247- 200301）對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度均大于99.5%；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 尿樣前處理

尿樣采自健康受試志愿者。精密吸取4mL尿液置于離心管中，加入200μL 5mol／L鹽酸溶液酸化，在離心力8000g條件下離心5min。取上清液過(guò)MCX固相萃取柱（預(yù)先分別用1mL甲醇和1 mL水活化、平衡），依次用1mL 0.1mol／L鹽酸溶液、1mL甲醇和1mL 5%（體積百分?jǐn)?shù)，下同）氨水溶液淋洗，用1mL甲醇-氨水（95∶5，v／v）溶液洗脫，接收洗脫液，待UPLC-ESI MS／MS分析。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

ACQUITY UPLC BEH Phenyl色譜柱（10cm×2.1mm，1.7μm）；流動(dòng)相 A為乙腈，流動(dòng)相B為0.3%甲酸溶液。洗脫梯度:0～3min，流動(dòng)相A比例由10%升至55%，4min時(shí)升至90%，4.1min降至10%，保持1.9min。流速:0.4mL／min；柱溫:35℃；樣品室溫度:10℃；進(jìn)樣體積:2μL。

電噴霧離子源正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；毛細(xì)管電壓:3.0kV；離子源溫度:300℃；去溶劑溫度:500℃，去溶劑氣流量:1000L／h；錐孔氣流量:30L／h；碰撞氣流量:0.15mL／min。待測(cè)物的監(jiān)測(cè)離子及駐留時(shí)間、錐孔電壓、碰撞電壓等參數(shù)見表1。

表1 麻黃堿和N-甲基麻黃堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS／MS parameters of ephedrine and N-methylephedrine

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在1.3節(jié)的條件下，混合對(duì)照品溶液、空白尿樣和口服急支糖漿制劑7d后的尿樣分別經(jīng)Oasis MCX固相萃取后的UPLC-MS／MS譜圖見圖1?？瞻啄驑又胁缓郎y(cè)物，且空白基質(zhì)對(duì)待測(cè)物的測(cè)定無(wú)干擾。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

近年來(lái)，采用離子對(duì)色譜法分析檢測(cè)生物堿的報(bào)道較多［17］，但這給質(zhì)譜檢測(cè)帶來(lái)困難。本文在酸性流動(dòng)相（流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液）條件下，分別考察了 HSS SB（5cm）、BEH C18（10cm）、CSH C18（5cm）、BEH Phenyl（10cm）4種色譜柱（柱內(nèi)徑均為2.1mm，填料粒徑均為1.7μm）對(duì)待測(cè)物靈敏度和分離度的影響（見圖2）。結(jié)果表明，以BEH Phenyl色譜柱為分離柱時(shí)，待測(cè)物的靈敏度較高，且分離度較好。

圖1 （a）混合對(duì)照品溶液（1μg／L）、（b）空白尿樣和（c）口服急支糖漿制劑7 d后的尿樣分別經(jīng)MCX柱固相萃取后的UPLC-MS／MS定性和定量離子流譜圖Fig.1 UPLC-MS／MS qualitative and quantitative ion current chromatograms of（a）mixed standard solution（1μg／L），（b）human blank urine，and（c）urine after 7 d administering Jizhi Syrup extracted by MCX solid phase extraction＊quantitative ion.

圖2 不同色譜柱對(duì)待測(cè)物靈敏度的影響Fig.2 Effect of different chromatographic columns on the sensitivity of the analytes

2.2.2 流動(dòng)相的選擇

以BEH Phenyl色譜柱作為分離柱，分別考察了酸性流動(dòng)相（流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液）和堿性流動(dòng)相（流動(dòng)相B為10mmol／L碳酸氫銨溶液，pH 10）對(duì)待測(cè)物靈敏度及峰形的影響（見圖3）。結(jié)果表明，待測(cè)物在酸性流動(dòng)相下的靈敏度略高于堿性流動(dòng)相，最終選擇酸性流動(dòng)相。

圖3 不同流動(dòng)相對(duì)待測(cè)物靈敏度的影響Fig.3 Effect of different mobile phases on the sensitivity of analytes

圖4 不同甲酸濃度對(duì)待測(cè)物靈敏度的影響Fig.4 Effect of different volume percentages of formic acid on the sensitivity of analytes

2.2.3 甲酸濃度的選擇

酸性流動(dòng)相中甲酸的濃度不同，對(duì)待測(cè)物靈敏度及峰形有不同程度的影響，因此以BEH Phenyl色譜柱作為分離柱，分別考察了0.1%甲酸溶液和0.3%甲酸溶液作為流動(dòng)相對(duì)待測(cè)物靈敏度的影響（見圖4）。結(jié)果表明，以0.3%甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，待測(cè)物的靈敏度較高，且峰形較好，最終選擇在酸性流動(dòng)相中添加0.3%的甲酸。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

2.3.1 固相萃取柱的選擇

由于待測(cè)組分呈堿性，在反相色譜填料上的保留很弱，因此很難利用一般的固相萃取小柱達(dá)到萃取的目的。本文考察了含有吸附性填料的Oasis HLB固相萃取柱和兼具離子交換和反相保留的Oasis MCX固相萃取柱對(duì)樣品的提取凈化效果。在不含待測(cè)物的空白尿中分別添加0.0250、0.250和2.50μg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2節(jié)的方法處理樣品，在1.3節(jié)的條件下進(jìn)行測(cè)定，比較樣品的基質(zhì)效應(yīng)（見表2）。

結(jié)果表明，HLB柱作為萃取柱會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的離子抑制效應(yīng)，影響檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度，故選擇MCX柱作為固相萃取柱。

2.3.2 洗脫條件的選擇

表2 Oasis HLB與Oasis MCX固相萃取柱萃取效果的比較（n＝6）Table 2 Comparison of the extraction efficiencies of Oasis HLB and Oasis MCX SPE columns（n＝6）

為了使待測(cè)物在固相萃取柱上得到最好的保留，上樣前需要對(duì)樣品進(jìn)行酸化以保證待測(cè)組分的完全離子化。試驗(yàn)表明，4mL尿液中加入200μL 5 mol／L的鹽酸溶液可保證待測(cè)組分完全吸附在填料上。尿液等生物樣品基質(zhì)非常復(fù)雜，采用質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性影響很大。為了盡可能地去除基質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用酸洗、醇洗和堿洗三步清洗，選擇性除去非極性的中性物質(zhì)、酸性以及極性堿性干擾物，最后采用堿性的甲醇溶液進(jìn)行洗脫。考察了不同比例的甲醇-氨水溶液的洗脫能力。結(jié)果表明，以甲醇-氨水（95∶5，v／v）溶液作為洗脫液時(shí)，待測(cè)物的回收率最高，故選擇其作為洗脫液。

2.4 線性范圍和檢出限

配制麻黃堿和N-甲基麻黃堿質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50、100μg／L的混合對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)氘代苯丙胺質(zhì)量濃度為10μg／L的對(duì)照品溶液。吸取上述系列濃度對(duì)照品溶液各250μL至7個(gè)離心管中，分別加入250μL內(nèi)標(biāo)溶液，最后用空白尿稀釋至10mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0.0250、0.0500、0.125、0.250、0.500、1.25、2.50μg／L 的樣品溶液。按1.2節(jié)的方法處理樣品，按1.3節(jié)的條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（C，μg／L）進(jìn)行線性回歸，得到麻黃堿和N-甲基麻黃堿在0.0250～2.50μg／L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性方程分別為Y＝8.12C-0.143（r＝0.9998）和 Y ＝4.09C＋0.735（r＝0.9992）。取線性最低點(diǎn)溶液逐倍稀釋，按1.3節(jié)的條件進(jìn)樣測(cè)定，得麻黃堿和N-甲基麻黃堿的檢出限 均 為 0.01 μg／L （S／N ＝ 3），均高于文獻(xiàn)［5-7，12，14-17，19］報(bào)道。

2.5 精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率

配制麻黃堿和N-甲基麻黃堿低、中、高3個(gè)濃度分別為0.0250、0.250和2.50μg／L的質(zhì)控（QC）樣品，每個(gè)濃度6份，按1.2節(jié)的方法處理樣品，在1.3節(jié)的條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積As，計(jì)算日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度；連續(xù)測(cè)定3d，計(jì)算日間精密度。同時(shí)，取空白尿，按1.2節(jié)的方法處理后，配制成低、中、高3個(gè)濃度的溶液，每個(gè)濃度6份，在1.3節(jié)的條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積Am；另取上述3個(gè)濃度的對(duì)照品溶液，不經(jīng)萃取直接進(jìn)樣，記錄峰面積為Astd。以As／Am計(jì)算提取回收率，Am／Astd計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表3。

表3 麻黃堿和N-甲基麻黃堿的精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率（n＝6）Table 3 Precisions，accuracies，matrix effects and recoveries of ephedrine and N-methylephdrine（n＝6）

2.6 樣品穩(wěn)定性

配制麻黃堿和N-甲基麻黃堿低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度分別為0.0250、0.250和2.50μg／L的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度3份。將上述樣品于室溫放置24h及經(jīng)過(guò)3次凍融循環(huán)后，按1.2節(jié)方法處理，并在1.3節(jié)的條件下進(jìn)行測(cè)定，考察其短期穩(wěn)定性及凍融穩(wěn)定性（見表4）。結(jié)果表明，麻黃堿和N-甲基麻黃堿在上述條件下均穩(wěn)定。

表4 麻黃堿和N-甲基麻黃堿的穩(wěn)定性（n＝3）Table 4 Stabilities of ephedrine and N-methylephedrine（n＝3）

2.7 真實(shí)樣品測(cè)定

采集健康志愿者口服10mL急支糖漿制劑7d后的尿樣，按1.2節(jié)方法處理樣品，并按1.3節(jié)的條件進(jìn)行測(cè)定，尿樣中麻黃堿和N-甲基麻黃堿的質(zhì)量濃度分別為0.034和0.137μg／L。表明該方法能夠有效測(cè)定尿樣中痕量的麻黃堿和N-甲基麻黃堿，大大提高檢測(cè)靈敏度，并延長(zhǎng)了尿樣中麻黃堿和N-甲基麻黃堿的檢測(cè)周期。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用Oasis MCX固相萃取柱對(duì)尿樣進(jìn)行提取、純化和富集，建立了SPE-UPLC-ESI MS／MS方法分析尿樣中痕量麻黃堿和N-甲基麻黃堿，顯著提高了檢測(cè)靈敏度，大大延長(zhǎng)了尿樣中麻黃堿和N-甲基麻黃堿的檢測(cè)周期，為未及時(shí)取樣且濃度極低的樣品中痕量麻黃堿和N-甲基麻黃堿的檢測(cè)提供了有效的方法。

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