超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人尿中毒死蜱的主要代謝產(chǎn)物3，5，6-三氯-2-吡啶醇★

王 娜，孫 娟，，石利利＊，吉貴祥，陳國松

（1.環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210042；2.南京工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京 210044）

毒死蜱（chlorpyrifos）是我國生產(chǎn)和使用量都非?？捎^的一種廣譜有機(jī)磷殺蟲劑［1］。毒死蜱被人體吸收后，主要分布在肝臟、腎臟、脾臟等血流量較高的器官，經(jīng)脂酶分解成一系列代謝產(chǎn)物，包括二乙基-硫代磷酸酯（diethyl thiophosphate，DETP）、二乙基-磷酸酯（diethyl phosphate，DEP）和3，5，6-三氯-2-吡啶醇（3，5，6-trichloro-2-pyridinol，3，5，6-TCP）［2］，結(jié)構(gòu)如圖1所示。研究［3］表 明，3，5，6-TCP是毒死蜱在人體中經(jīng)腎臟排泄的最主要的代謝產(chǎn)物。因此，人尿液中3，5，6-TCP的濃度是人體毒死蜱生物負(fù)荷的一個特異性生物監(jiān)測指標(biāo)，可反映毒死蜱這種外源性污染物質(zhì)對人體產(chǎn)生的危害，如抑制人體紅細(xì)胞乙酰膽堿酯酶活性以及導(dǎo)致血色素濃度下降等［4］。

圖1 （a）毒死蜱、（b）3，5，6-TCP、（c）DETP和（d）DEP的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of（a）chlorpyrifos，（b）3，5，6-TCP，（c）DETP and（d）DEP

目前，3，5，6-TCP的測定大都是以血漿或尿液為基質(zhì)。儀器分析方法包括氣相色譜（GC）法［5］、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法［3，6］、高效液相色譜（HPLC-UV）法［7，8］、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）法［9］等。運(yùn)用GC法時，前處理時需要對3，5，6-TCP進(jìn)行衍生化，合成易于氣化的產(chǎn)物。衍生化過程不僅繁瑣而且具有重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)。運(yùn)用HPLC-UV法時，紫外檢測器的非特異性制約了整個分析方法的靈敏度，同時對生物樣品的凈化提出了非常嚴(yán)格的要求，否則極易出現(xiàn)假陽性。有文獻(xiàn)［2］報道運(yùn)用LC-MS／MS法測定尿液中3，5，6-TCP，定量限高達(dá)0.25mg／L，所以只能用于毒死蜱急性中毒的鑒定，無法用于毒死蜱的人體健康風(fēng)險暴露評估以及其生物負(fù)荷的痕量監(jiān)測。因此，建立毒死蜱的主要代謝產(chǎn)物3，5，6-TCP在人尿中的痕量分析技術(shù)具有重要的應(yīng)用價值。

本研究采用溶劑萃取前處理結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS／MS），建立了人尿液中3，5，6-TCP的分析測定方法。方法操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、重現(xiàn)性強(qiáng)，并已成功應(yīng)用于人尿液實際樣品中3，5，6-TCP的測定，取得了滿意的結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜儀和Quattro Premier XE質(zhì)譜儀（美國 Waters公司）；AG-285電子天平（瑞士 Mettler公司）；MG-2200氮吹儀（日本EYELA公司）；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（瑞士Buchi公司）；WH-3微型旋渦混合儀（上海楚定分析儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）。

3，5，6-TCP和酮洛芬標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr.Ehrenstorfer公司）。二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇均為色譜純，德國Merck公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別稱取10mg（精確至0.1mg）3，5，6-TCP和酮洛芬標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1000mg／L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，避光保存于4℃。用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)貯備液至不同濃度，配制標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確吸取尿液10.0mL置于125mL分液漏斗中，加入內(nèi)標(biāo)物酮洛芬20μL（100mg／L）。加入20 mL二氯甲烷-乙酸乙酯（20∶80，v／v）溶液，充分振搖萃取，重復(fù)一次。上清液移至雞心瓶，旋蒸濃縮至約2mL，用移液器移至試管中。用提取溶劑清洗雞心瓶2～3次，合并至試管中。于40℃水浴中氮?dú)獯蹈?，殘留物?00μL的10%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈-水溶液渦旋30s溶解，經(jīng)0.22μm膜過濾后待UPLCMS／MS分析。

1.4 UPLC-MS／MS條件

1.4.1 UPLC條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1mm，1.7μm）；流動相A為乙腈，B為水。流動相的梯度洗脫程序為:0～2min，20%A～30%A；2～3min，30%A～40%A；3～4min，40%A；4～5min，40%A～30%A；5～6min，30%A～20%A。流速為0.3mL／min；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為5μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

采用負(fù)離子模式的電噴霧電離（ESI-）；SIR（selective ion recording）方式掃描；毛細(xì)管電壓:3.5 kV；離子源溫度:120℃；脫溶劑氣溫度:350℃；錐孔反吹氣流量:50L／h；脫溶劑氣流量:600L／h；萃取器電壓:3.0V；RF透鏡電壓:0.2V；低端分辨率1:15.0；低端分辨率2:15.0；高端分辨率1:15.0；高端分辨率2:15.0；離子能量1:0.5；離子能量2:0.5；碰撞氣壓力:0.343Pa；3，5，6-TCP定量離子:m／z198，定性離子:m／z196；酮洛芬定量離子:m／z 253.12；離子駐留時間:0.5s；錐孔電壓:-30V。

2 結(jié)果與討論

2.1 空白基質(zhì)的選擇

采用人工合成尿液進(jìn)行試驗，雖然本底較為干凈，但是其中不含蛋白質(zhì)，與實際尿液有一定的差距，不能有效反映人實際尿液基質(zhì)的復(fù)雜性。而采用小鼠尿液作為空白基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其存在較高的本底值，不適合測定方法的建立。因此，本實驗通過對不同人的尿液進(jìn)行篩選，選擇無3.5.6-TCP干擾的人尿液作為空白基質(zhì)。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取方式的選擇

尿液是內(nèi)源性物質(zhì)較多的復(fù)雜生物基質(zhì)，目前報道的尿液中有機(jī)物的痕量分析前處理大多采用固相萃取法（SPE）［10，11］。對于小鼠和人尿液中3，5，6-TCP的分析測定，有報道采用液液萃取法［7，8］。因此，本研究對固相萃取法和液液萃取法分別進(jìn)行了嘗試。分別使用極性較大的C8小柱（200mg，6 mL，美國 Waters公司）、Florisil小柱（500mg，6 mL，美國ProElut公司）和 HLB小柱（200mg，6 mL，美國 Waters公司）對尿液中的3.5.6-TCP進(jìn)行提取，結(jié)果均未提取出來。這可能是因為在固相萃取過程中固相填料對3.5.6-TCP的吸附力不夠大，當(dāng)尿液樣本通過吸附劑床時，3，5，6-TCP未能在其表面吸附。而選用有機(jī)溶劑液液萃取法進(jìn)行前處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯可以將待測物3，5，6-TCP提取出來，但提取回收率并不是特別高。

2.2.2 提取溶劑的選擇

分別用乙酸乙酯、二氯甲烷-乙酸乙酯（20／80，v／v）和乙酸乙酯-乙腈（70／30，v／v）溶液作為尿液樣本的提取溶劑，考察不同提取溶劑對待測物的提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二氯甲烷-乙酸乙酯（20／80，v／v）溶液對待測物的提取回收率最高。由于3，5，6-TCP具有羥基結(jié)構(gòu)，于是考察了酸化提取對回收率的影響。酸化提取中，加入一定量的濃鹽酸調(diào)節(jié)尿液樣本pH達(dá)到4，再用二氯甲烷-乙酸乙酯（20／80，v／v）溶液進(jìn)行液液萃取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸化提取并未大幅度提高待測物的提取回收率，因此最終選用二氯甲烷-乙酸乙酯（20／80，v／v）溶液進(jìn)行中性提取，這與3，5，6-TCP的pKa7.5的理化性質(zhì)相一致［2］。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用ESI方式，分別考察了ESI／全掃描（full scan）在正、負(fù)離子模式下待測物峰的響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在負(fù)離子模式下3，5，6-TCP的基峰為［MH］-峰（m／z 198），而在正離子模式下未找到明顯的碎片離子峰。運(yùn)用子離子掃描（daughter scan）模式，以m／z198為母離子，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)響應(yīng)穩(wěn)定且較強(qiáng)的碎片峰，這也與3，5，6-TCP的結(jié)構(gòu)相符。因此，待測物的質(zhì)譜檢測定量離子為SIR模式下的m／z198。

在上述 UPLC-MS／MS 測定條件下，3，5，6-TCP和內(nèi)標(biāo)酮洛芬的保留時間分別為3.93和4.80 min，空白尿液樣品無干擾?？瞻啄蛞?、加標(biāo)樣品和實際樣品的典型色譜圖如圖2所示。

圖2 （a）空白尿液、（b）加標(biāo)尿液和（c）實際尿樣的色譜圖Fig.2 Chromatograms of（a）a blank urine sample，（b）a spiked urine sample and（c）a real urine sample

2.4 工作曲線、檢出限和定量限

精密吸取3，5，6-TCP標(biāo)準(zhǔn)工作液添加到10 mL空白尿樣中，使尿液樣本中3，5，6-TCP的質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4 mg／L。按1.3節(jié)前處理方法進(jìn)行操作，在優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜條件下分析，記錄3，5，6-TCP色譜峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積（Ar）。3，5，6-TCP與內(nèi)標(biāo)的峰面積比 R （R＝As／Ar）對質(zhì)量濃度（C，mg／L）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為R＝0.09456C-0.00174，r2＝0.998。3，5，6-TCP在0.005～0.4 mg／L范圍內(nèi)色譜響應(yīng)線性關(guān)系良好。在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)化合物，以目標(biāo)化合物3倍信噪比的加標(biāo)水平為LOD，平行測定5次；以目標(biāo)化合物10倍信噪比的加標(biāo)水平為LOQ，平行測定5次。方法的LOD為0.41μg／L，LOQ為5μg／L。

2.5 加標(biāo)回收率和精密度

配制質(zhì)量濃度為10、20和200μg／L的3，5，6-TCP空白加標(biāo)尿液樣本各3份，分析結(jié)果如表1所示，3，5，6-TCP的平均回收率為95.33%～99.80%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.60%～9.86%。

表1 3，5，6-TCP在尿液中的添加回收率（n＝3）Table 1 Recovery of 3，5，6-TCP spiked in a human urine sample（n＝3）

配制3，5，6-TCP 質(zhì)量濃度為10、20和200 μg／L的空白加標(biāo)尿液樣本，按已確定尿液樣品處理方法，同樣操作、測定以及計算。在一個分析日內(nèi)測定5次，計算日內(nèi)精密度；在不同分析日（5d）制備并測定3個批次加標(biāo)樣本，計算日間精密度。結(jié)果表明，對尿液樣品中3，5，6-TCP的分析精密度良好，RSD均小于15%（見表2）。

表2 日內(nèi)和日間精密度試驗數(shù)據(jù)Table 2 Results of intra-and inter-day precision tests

2.6 實際樣品的處理和分析

采集了某農(nóng)藥廠附近居民的晨尿40份，包括幼齡兒童（20份）及其父親或母親的尿液。按1.3節(jié)實驗方法處理樣品，測定結(jié)果如表3所示。

表3 兒童和成人的尿液中3，5，6-TCP的分析結(jié)果Table 3 Analysis results of 3，5，6-TCP in children’s and adults’urine

結(jié)果表明，半數(shù)的兒童尿液中檢出3，5，6-TCP，最高檢出質(zhì)量濃度為72.23μg／L；1／3的成人尿液中檢測出3，5，6-TCP，最高檢出質(zhì)量濃度為83.50μg／L，反映出毒死蜱的人體生物負(fù)荷水平。毒死蜱的人體內(nèi)暴露一方面可能與農(nóng)藥廠周邊人群吸入了含有毒死蜱的大氣有關(guān)，另一方面可能與食用了含毒死蜱殘留的農(nóng)作物有關(guān)。

3 結(jié)論

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，用于分析人體尿液中毒死蜱主要代謝產(chǎn)物3，5，6-TCP。驗證結(jié)果表明該方法操作簡單，靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度和定量分析線性關(guān)系均良好，已成功應(yīng)用于實際測定某農(nóng)藥廠附近居民尿液中3，5，6-TCP的含量。該方法可以為毒死蜱的人體健康風(fēng)險暴露評估以及其生物負(fù)荷的痕量監(jiān)測提供有效的方法支撐，同時為揭示毒死蜱在體內(nèi)的代謝方式和暴露途徑，科學(xué)評價毒死蜱暴露水平與其代謝物之間的關(guān)系提供了研究基礎(chǔ)。

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