適用于質(zhì)譜分析的在線固相萃取除鹽方法

陳 靜，劉召金，戴振宇，安保超，許 群＊，張祥民

（1.復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系，上海 200433；2.賽默飛世爾科技中國有限公司，上海 201203；3.山東省鄒城市食品質(zhì)量檢驗中心，山東 鄒城 273500）

質(zhì)譜（MS）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)已經(jīng)成為分析復(fù)雜生化樣品的有效手段。但生化樣品如多肽和蛋白質(zhì)的制備過程中所大量使用的高濃度鹽會干擾質(zhì)譜分析的離子化過程，從而導(dǎo)致分析物峰強(qiáng)度降低和離子源污染，致使檢測無法進(jìn)行。因此，質(zhì)譜檢測前對樣品的除鹽顯得尤為重要。目前常用的除鹽方法主要是固相萃取技術(shù)（SPE），即蛋白質(zhì)或多肽保留在吸附材料上，鹽類不吸附而被除去，然后將保留的蛋白質(zhì)或多肽洗脫下來進(jìn)行檢測。常用的吸附材料有反相固定相、高分子聚合物、石墨化碳、納米材料等。將這些材料填充或者整體聚合在小柱或微柱中，用于蛋白質(zhì)或多肽的除鹽與富集［1］。常見的 SPE 有離線（off-line）和在線（online）技術(shù)。與前者相比，后者具有自動化程度高、節(jié)約時間和方法重現(xiàn)性好等優(yōu)點，其相關(guān)技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用日益受到重視［2-6］。

本文建立了一種簡單、快速和有效的在線固相萃取方法，可用于質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析生化樣品的高通量除鹽。方法分為單柱和雙柱兩種模式，借助于包含雙梯度泵、自動進(jìn)樣器和配有2位十通切換閥的柱溫箱的高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)，在色譜管理軟件的控制下，完成樣品的在線除鹽，實現(xiàn)了除鹽自動化。以磷酸緩沖鹽質(zhì)量濃度為1.0 g／L的寡核苷酸樣品為例，在雙萃取柱模式下的除鹽、淋洗以及分離測定在1.1min即可完成，大大提高了工作效率。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo UltiMate 3000高效液相色譜儀，帶有雙三元梯度泵（DGP-3600A），配置六通道在線脫氣機(jī)（SRD-3600）、自動進(jìn)樣器（WPS-3000TSL，帶大體積進(jìn)樣組件）、柱溫箱（TCC-3200RS，帶2位十通切換閥）、二極管陣列檢測器（DAD-3400RS）；變色龍色譜管理軟件（Chromeleon?6.8SR9），美國賽默飛世爾公司。

乙腈（色譜純），去離子水（18.2MΩ·cm），碳酸氫銨、甲酸、溴化鉀均為分析純。

1.2 樣品

含高濃度磷酸緩沖鹽的寡核苷酸樣品由江蘇某生化制品公司提供；經(jīng)過純化和除鹽的牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品由上海阿敏生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 在線固相萃取除鹽單萃取柱模式的流程

以對含有4g／L KBr的BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行除鹽為例，描述本研究中在線串聯(lián)固相萃取除鹽單萃取柱模式的流程（見圖1）。十通閥1-10位通時，上樣泵以0.1%（如無特殊說明均為體積分?jǐn)?shù)）HCOOH溶液為流動相，1.5mL／min流速進(jìn)樣。樣品溶液中的BSA被保留在SPE柱（Acclaim PA II Guard，10mm×4.3mm，5μm）上，而KBr不保留，被淋洗出SPE柱。在SPE柱上完成除鹽后，通過閥切換使1-2位通，分析泵以0.1%HCOOH溶液-乙腈（6∶4，v／v）為流動相，1mL／min流速淋洗SPE柱，將富集的BSA洗脫。通過流路①與MS直接連接進(jìn)行分析（on-line SPE-MS），或與紫外（UV）檢測器連接直接進(jìn)行在線固相萃取-流動注射（on-line SPE-flow injection）分析；或通過流路②經(jīng)過色譜柱（Acclaim PAⅡ，33mm×3.0mm，3 μm）分離后進(jìn)入 MS進(jìn)行分析（on-line SPE-LCMS），或使用紫外檢測器進(jìn)行分析（on-line SPEHPLC）。

圖1 在線固相萃取除鹽單萃取柱模式的流程圖Fig.1 Schematic diagram of the on-line SPE desalting system of single SPE column mode

1.4 在線固相萃取除鹽雙萃取柱模式的流程

同樣，以對含有4g／L KBr的BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行除鹽為例，描述本研究中的在線固相萃取除鹽雙萃取柱模式的流程（見圖2）。上樣泵和分析泵所用的流動相、色譜柱以及萃取和淋洗條件均與單柱模式相同。十通閥1-2位通時，在SPE柱1上進(jìn)樣和除鹽（周期1）。上樣泵進(jìn)樣后，樣品溶液中的BSA被保留在SPE柱1上，而KBr不保留，被淋洗出SPE柱。當(dāng)周期1完成，將十通閥切換至1-10位通，周期2（在SPE柱2上進(jìn)樣和除鹽）開始，其使用的SPE柱和條件均與周期1相同。與此同時，分析泵將富集的BSA洗脫，通過流路①與MS或與紫外檢測器直接連接進(jìn)行分析；或通過流路②經(jīng)過色譜柱（Acclaim 300C18，50mm×4.6mm，3μm）分離后進(jìn)入MS或紫外檢測器進(jìn)行分析。當(dāng)周期2完成，將十通閥切換回至1-2位通，周期1又開始運轉(zhuǎn)；同時，富集在SPE柱2上的BSA則被洗脫、檢測或經(jīng)過分離后檢測。這樣，SPE柱1和2輪流工作，高效率地完成樣品的在線除鹽及檢測。

圖2 在線固相萃取除鹽雙萃取柱模式的流程圖Fig.2 Schematic diagram of the on-line SPE desalting system of dual SPE column mode

2 結(jié)果與討論

2.1 除鹽效果的評價

提高在線固相萃取除鹽效果的方法一般有兩種，一是延長除鹽時間，也就是延長切閥時間；二是增大除鹽的流速。由于生化樣品制備時通常所使用的緩沖鹽溶液如磷酸鹽溶液沒有紫外吸收，在方法開發(fā)時可以通過向樣品溶液中加入有紫外吸收的鹽如KBr來判斷除鹽效果。

圖3是單萃取柱模式下，不同質(zhì)量濃度KBr溶液進(jìn)行在線固相萃取-流動注射分析的色譜圖?？梢杂^察到，0.5min時2.0和4.0g／L的 KBr溶液尚有殘余，但1.5min時4.0g／L的KBr溶液也已經(jīng)完全除去，表明延長固相萃取除鹽時間，在線固相萃取除鹽效果得到提高。

圖3 在線固相萃取除鹽單萃取柱模式下不同質(zhì)量濃度KBr溶液的流動注射分析色譜圖Fig.3 Chromatograms of on-line SPE-flow injection analysis of KBr solutions with different mass concentrations using the on-line SPE desalting single SPE column mode

圖4 在線固相萃取除鹽單萃取柱模式下的含有2.0 g／L KBr的寡核苷酸樣品在除鹽流速為（a）1.0 mL／min和（b）2.0 mL／min時的高效液相色譜圖Fig.4 Chromatograms of on-line SPE-HPLC analysis of an oligonucleotide sample spiked with 2.0 g／L KBr and desalted at the flow rates of（a）1.0 mL／min and（b）2.0 mL／min using the on-line SPE desalting single SPE column mode

圖4是單萃取柱模式下不同除鹽流速時，含有2.0g／L KBr的寡核苷酸樣品的在線固相萃取-高效液相色譜圖。如圖4a所示，除鹽流速為1.0 mL／min時寡核苷酸色譜峰后有一個小色譜峰。經(jīng)過紫外吸收光譜比對可確認(rèn)該峰是殘留的KBr，說明樣品中的鹽沒有完全去除。而如圖4b所示，當(dāng)除鹽流速增大至2.0mL／min時該色譜峰消失，表明樣品中的鹽已經(jīng)去除。因此，通過增大固相萃取除鹽的流速，可以提高在線固相萃取除鹽效果。

2.2 在線固相萃取除鹽方法的重現(xiàn)性

通過計算雙萃取柱模式下連續(xù)進(jìn)樣10次含有4.0g／L KBr的BSA溶液（每個萃取柱上各5次），所得到的BSA色譜峰（見圖5）的保留時間和峰面積的RSD來評估在線固相萃取除鹽方法的重現(xiàn)性。BSA保留時間的RSD為0.1%，峰面積的RSD為1.0%，說明該方法的重現(xiàn)性良好。

圖5 在線固相萃取除鹽雙萃取柱模式下連續(xù)進(jìn)樣10次含有4.0 g／L KBr的BSA溶液（每個萃取柱上各5次）的高效液相色譜圖Fig.5 Chromatograms of 10 consecutive injections（5 injections for each SPE column）on on-line SPE-HPLC of BSA spiked with 4.0 g／L KBr using the on-line SPE desalting dual SPE column mode

當(dāng)樣品溶液中的鹽濃度不高時，采取雙萃取柱模式，通過適當(dāng)縮短閥切換時間可以大大提高在線固相萃取除鹽的效率；但頻繁的閥切換可能會導(dǎo)致方法重現(xiàn)性的降低。因此，機(jī)械性能良好的雙梯度泵是實現(xiàn)這一目的的保證。圖6是磷酸緩沖鹽質(zhì)量濃度低于1.0g／L的寡核苷酸樣品在雙萃取柱模式下的液相色譜圖，閥切換時間縮短至0.4min，連續(xù)進(jìn)樣8次（每個萃取柱上各4次）。除鹽、淋洗和分離測定在1.1min即可完成。寡核苷酸保留時間的RSD為0，峰面積的RSD為1.5%。

圖6 在線固相萃取除鹽雙萃取柱模式下連續(xù)進(jìn)樣8次寡核苷酸樣品（每個萃取柱上各4次）的高效液相色譜圖Fig.6 Chromatograms of 8 consecutive injections（4injections for each SPE column）on on-line SPEHPLC of the oligonucleotide sample using the online SPE desalting dual SPE column mode

3 結(jié)語

本文建立了簡單、快速和有效的適用于與質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的生化樣品在線高通量固相萃取除鹽方法。方法分為單柱和雙柱兩種模式，樣品除鹽過程完全由液相色譜系統(tǒng)自動完成。與傳統(tǒng)除鹽方法相比，該方法具有樣品需求量小、試劑消耗量少、操作簡單、分析成本低廉、除鹽效率高等特點，大大提高了工作效率。因此，該技術(shù)在生化樣品的分析中有很好的應(yīng)用前景。

［1］Cook K，Thayer J.Bioanalysis，2011，3（10）:1109

［2］Sun L L，Duan J C，Tao D Y，et al.Rapid Commun Mass Spectrom，2008，22（15）:2391

［3］Fountain K J，Gilar M，Gebler J C.Rapid Commun Mass Spectrom，2004，18（12）:1295

［4］Yoshida H，Mizukoshi T，Hirayama K，et al.J Chromatogr A，2006，1119（1／2）:315

［5］Thayer J R，Puri N，Burnett C，et al.Anal Biochem，2010，399（1）:110

［6］Liu J，Pan Y H，Xu Q，et al.Scientia Agricultura Sinica（劉靜，潘映紅，徐琴，等.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)），2009，42（3）:772