RP－HPLC法測定人血草中黃連堿和白屈菜紅堿的含量

徐 幫 郭玲芝 程 凡 汪鋆植 鄒 坤

（天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（三峽大學(xué)），湖北 宜昌 443002）

人血草Stylophorum lasiocarpum（Oliv.）Fedde是罌粟科金罌粟屬植物，又名豆葉七，人血七、野人血草、大金盆.產(chǎn)湖北西部、陜西南部和四川東部.以全草入藥，有活血、調(diào)經(jīng)、舒筋、散淤、止痛等功效，用于月經(jīng)不調(diào)，跌打損傷［1－2］.人血草作為民間藥在湖北省及周邊民間應(yīng)用歷史悠久，范圍廣范.本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)人血草藥材的顯微特征、理化鑒別、水分、總灰分、酸溶性浸出物、醇溶性浸出物進(jìn)行了相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［3］.研究表明，人血草的主要化學(xué)成分為四氫黃連堿、血根堿、白屈菜紅堿、黃連堿別隱品堿、原阿片堿等生物堿類化合物.其中黃連堿和白屈菜紅堿的含量較大，且為其主要的生理活性成分［4－5］.本文采用高效液相色譜法，對(duì)人血草藥材中黃連堿和白屈菜紅堿進(jìn)行了含量測定，通過試驗(yàn)分析，結(jié)果表明該方法簡單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可作為質(zhì)量控制的方法.

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Varian210分析型高效液相色譜系統(tǒng)210型二元梯度泵，210型紫外檢測器，美國 Varian公司；ME215S型1／10萬電子天平，德國Sartorius公司；S－3100紫外分光光度計(jì)，韓國Sinco公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本EYELA.

1.2 試劑與試藥

黃連堿和白屈菜紅堿均為本實(shí)驗(yàn)室自人血草中分離并鑒定，以HPLC面積歸一法測定其純度數(shù)大于98%；甲醇和乙腈為色譜純，水為高純水，其它試劑均為分析純.人血草全草分別采集自中國湖北省神農(nóng)架、五峰、長陽，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室楊進(jìn)副教授鑒定為Stylophorum lasiocarpum（Oliv.）Fedde.原植物及藥材標(biāo)本現(xiàn)保存于天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（三峽大學(xué)）.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

YMC－Pack ODS－AA色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流速1.0mL·min－1；檢測波長280nm；進(jìn)樣量20μL；柱溫30℃；流動(dòng)相為乙腈（B）－水相（0.2%磷酸＋0.2%三乙胺）（A）梯度洗脫，0～1min，20%B，80%A；1～10min，40%B，60%A；10～20min，50%B，50%A；20～30min，100%B.

2.2 試驗(yàn)溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品黃連堿6.62mg和白屈菜紅堿3.18mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成混合對(duì)照品貯備液.以0.22μm微孔濾膜過濾，低溫避光保藏備用.

2.2.2 供試品溶液的制備

取人血草藥材粉末（過40目篩，50℃烘干）約3.0 g，精密稱定，置于250mL圓底燒瓶中，加入6倍量的95%乙醇溶液，加熱回流2次，每次60min，收集醇溶液，蒸干，殘?jiān)?0mL三蒸水溶解，用0.1mol·L－1磷酸調(diào)pH至3～4，靜置過夜，過濾，用0.1mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7～8，用等量氯仿萃取3次，收集氯仿液，回收氯仿，殘?jiān)眉状既芙庥?mL容量瓶中，搖勻，定容，得供試品溶液.以0.22μm微孔濾膜過濾，低溫避光保藏備用.

對(duì)照品以及供試品的色譜圖如圖1所示.

圖1 對(duì)照品和供試品的HPLC圖

2.3 線性關(guān)系試驗(yàn)

分別吸取對(duì)照品貯備液0.2，0.4，0.6，1，2，4mL置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，各進(jìn)樣20μL，以色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以黃連堿和白屈菜紅堿的濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸.黃連堿和白屈菜紅堿的回歸方程分別為:

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品貯備液6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，進(jìn)樣量20μL，每個(gè)濃度進(jìn)樣3次，測定黃連堿和白屈菜紅堿的色譜峰面積，計(jì)算RSD（n＝6）分別為1.8%，1.6%.

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取人血草藥材粉末5份，每份約3.0g，精密稱定.按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測定黃連堿和白屈菜紅堿的色譜峰面積，計(jì)算RSD（n＝5）分別為2.5%，2.3%.

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液20μL，分別于0，4，12，24，36，48h進(jìn)樣分析，測定黃連堿和白屈菜紅堿的色譜峰面積，計(jì)算 RSD（n＝6）分別為1.3%，1.2%，結(jié)果表明48h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好.

2.7 回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品6份，每份約2.0g，精密稱定.各樣品分別加入對(duì)照品貯備液適量，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測定.計(jì)算回收率結(jié)果見表1.

表1 黃連堿和白屈菜紅堿加樣回收率（n＝6）

2.8 樣品測定

取不同產(chǎn)地的人血草藥材各3份，每份約3.0g，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中黃連堿和白屈菜紅堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù).結(jié)果見表2和表3.

表2 不同產(chǎn)地人血草樣品中黃連堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)

表3 不同產(chǎn)地人血草樣品中白屈菜紅堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 討 論

為了能在適宜的分析時(shí)間內(nèi)獲得指標(biāo)成份的完全分離，在實(shí)驗(yàn)中對(duì)流動(dòng)相體系進(jìn)行了反復(fù)摸索，分別用甲醇－水、乙腈－水、乙腈－醋酸水、乙腈－磷酸水、乙腈－三乙胺水、乙腈－磷酸－三乙胺水等體系進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)甲醇－水洗脫基線不平穩(wěn)，分離度差，乙腈－醋酸水、乙腈－磷酸水和乙腈－三乙胺水的分離效果同乙腈－水體系的分離效果相比并沒有進(jìn)一步改善，而以乙腈－磷酸－三乙胺水為最佳，黃連堿和白屈菜紅堿的峰形較好，分離度較高.本實(shí)驗(yàn)采用的供試品溶液為氯仿萃取的粗提液，為保護(hù)色譜柱選用流動(dòng)相梯度洗脫，可將強(qiáng)保留物質(zhì)洗脫下來.

氯仿萃取之前的pH為7～8，若溶液pH過高，堿性太強(qiáng)容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，對(duì)生物堿的提取不利.

本試驗(yàn)同時(shí)測定黃連堿和白屈菜紅堿，在選定的色譜條件下，方法的精密度及重復(fù)性良好，穩(wěn)定性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，故可作為人血草藥材質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn).

［1］中國科學(xué)院中國植物編輯委員會(huì).中國植物志:第32卷［M］.北京:科學(xué)出版社，1999.

［2］方志先，廖朝林.湖北恩施藥用植物志（上）［M］.武漢:湖北科學(xué)出版社，2006:383.

［3］朱靖靜，楊 進(jìn)，鄒 坤，等.人血草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2009，15:22－24.

［4］Slavik J，Hanus V，Slavikova L.Alkaloids of the paraveraceae.91.Alokaloids from Stylophorum lasiocarpum（Oliv.）Fedde［J］.Collection of Czechoslovak Chemical Communications，1991，56（5）:1116－1122.

［5］中華本草編委會(huì).中華本草:第9卷［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:672.