p27蛋白與細(xì)胞周期蛋白D1在疣狀胃炎和胃癌組織中的表達(dá)及其意義

顧 湘 朱海杭 陳 潔 王慶娜 陶佳麗 陳 健 向 旭

揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科(225001)

疣狀胃炎(verrucous gastritis)是一種以胃黏膜多發(fā)痘疹樣隆起伴臍樣凹陷為特征的慢性胃炎，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，內(nèi)鏡下可分為未成熟型和成熟型疣狀胃炎兩種類型，病理學(xué)上存在一定比例的腸化生和異型增生。研究發(fā)現(xiàn)疣狀胃炎與胃癌的發(fā)生可能存在相關(guān)性，但其癌變的分子機(jī)制尚不清楚。目前關(guān)于疣狀胃炎中胃癌相關(guān)基因的研究報(bào)道較少，本研究通過(guò)免疫組化法檢測(cè)抑癌基因p27蛋白和細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)在慢性非萎縮性胃炎組織、疣狀胃炎組織和胃癌組織中的表達(dá)，旨在探討?zhàn)酄钗秆着c胃癌之間的關(guān)系及其可能存在的癌變分子機(jī)制。

對(duì)象與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

收集2012年1～12月?lián)P州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院胃鏡室和手術(shù)室符合研究要求的標(biāo)本，隨機(jī)采取慢性非萎縮性胃炎、未成熟型疣狀胃炎、成熟型疣狀胃炎、胃癌組織標(biāo)本各40例，常規(guī)固定后石蠟包埋。160例患者中，男107例，女53例，年齡26～87歲，平均56.21歲。所有入選者均由胃鏡和病理檢查確診，近4周內(nèi)未服用過(guò)抑酸藥、鉍劑、抗菌藥物、非甾體消炎藥;胃炎患者不伴有食管癌、胃癌、消化性潰瘍;胃癌患者未行放化療。疣狀胃炎分型參照日本學(xué)者Kawai等［1］提出的標(biāo)準(zhǔn)，未成熟型:隆起的病灶主要由組織炎性水腫所致，病灶隆起較低，周邊高起平緩，坡度小，頂部臍樣凹陷較大較淺;成熟型:隆起的病灶由組織增生引起，增生病灶隆起較高，坡度較陡，頂部臍樣凹陷較小且深，或無(wú)凹陷而呈息肉樣隆起。

二、主要試劑

p27蛋白兔抗人單克隆抗體、cyclin D1兔抗人單克隆抗體、兔超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒和DAB試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。幽門螺桿菌(Hp)快速尿素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上?；萏┽t(yī)療科技公司。

三、方法

采集新鮮標(biāo)本以快速尿素酶法檢測(cè)疣狀胃炎患者Hp感染情況。蠟塊4 μm連續(xù)切片后行常規(guī)HE染色鏡檢觀察胃炎病理表現(xiàn)。免疫組化二步法檢測(cè)四種組織中p27蛋白、cyclin D1的表達(dá)(抗體工作濃度分別為1∶100和1∶50)，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用已知的陽(yáng)性乳腺癌切片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。HE和免疫組化染色結(jié)果均由病理醫(yī)師雙盲鏡檢，病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2012年“中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn)”［2］。以細(xì)胞核呈棕黃色顆粒為p27蛋白和cyclin D1陽(yáng)性反應(yīng)。免疫組化結(jié)果按染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量評(píng)分［3］。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，染色強(qiáng)度:無(wú)色0分、淡黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞0分、≤25%1分、26% ～50%2分、51% ～75%3分、＞75%4分。總分為兩者評(píng)分之積，≤3分為陰性，＞3分為陽(yáng)性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、p27蛋白和cyclin D1的表達(dá)

未成熟型疣狀胃炎組p27蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于胃癌組(χ2=8.901，P=0.005)，與慢性非萎縮性胃炎組相比無(wú)明顯差異(χ2=0.738，P=0.568);成熟型疣狀胃炎組p27蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于慢性非萎縮性胃炎組和未成熟型疣狀胃炎組(χ2=9.833，P=0.003;χ2=5.495，P=0.034)，與胃癌組相比無(wú)明顯差異(χ2=0.450，P=0.655)。未成熟型疣狀胃炎組、成熟型疣狀胃炎組cyclin D1陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于慢性非萎縮性胃炎組(χ2=7.813，P=0.010;χ2=9.028，P=0.005)，但均顯著低于胃癌組 (χ2=5.580，P=0.024;χ2=5.051，P=0.042)，而未成熟型與成熟型疣狀胃炎之間無(wú)明顯差異(χ2=0.052，P ＞0.999)(見(jiàn)表1、圖1 ～2)。

二、相關(guān)性分析

52例p27蛋白陽(yáng)性表達(dá)的疣狀胃炎患者中，cyclin D1陽(yáng)性19例，陰性33例，兩者表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(r= －0.164，P=0.145);18 例 p27 陽(yáng)性表達(dá)的胃癌中，cyclin D1陽(yáng)性13例，陰性5例，兩者表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.019，P=0.576)。

表1 四組p27蛋白、cyclin D1的陽(yáng)性表達(dá)率比較n(%)

三、p27蛋白、cyclin D1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

本組80例疣狀胃炎患者中伴Hp感染30例(37.5%)，其中未成熟型14例，成熟型16例;伴腸化生23例(28.8%)，其中未成熟型11例，成熟型12例;伴異型增生8例(10.0%)，其中未成熟型3例，成熟型5例。未成熟型與成熟型疣狀胃炎患者Hp感染、腸化生和異型增生發(fā)生率均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。40例慢性非萎縮性胃炎患者中Hp感染5 例(12.5%)，顯著低于疣狀胃炎(χ2=8.067，P=0.005);腸化生3 例(7.5%)，顯著低于疣狀胃炎(χ2=7.095，P=0.009);無(wú)異型增生，與疣狀胃炎相比無(wú)明顯差異(χ2=4.268，P=0.051)。

疣狀胃炎患者的性別、年齡和Hp感染與p27蛋白和cyclin D1的表達(dá)均明顯無(wú)關(guān)(P＞0.05);腸化生組p27蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于無(wú)腸化生組(43.5%對(duì)73.7%，P ＜0.05)，cyclin D1 陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于無(wú)腸化生組(60.9%對(duì)33.3%，P ＜0.05);異型增生組p27蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于無(wú)異型增生組(25.0%對(duì) 69.4%，P ＜0.05)，而 cyclin D1 陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)明顯差異(62.5%對(duì)38.9%，P＞0.05)(見(jiàn)表2)。

討 論

胃癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的逐步發(fā)展的復(fù)雜過(guò)程，癌基因的激活或突變、抑癌基因的失活或抑制均可打破胃上皮細(xì)胞的增殖與凋亡平衡，參與癌變的過(guò)程。疣狀胃炎與胃癌關(guān)系密切，在第十屆世界胃腸病大會(huì)上，疣狀胃炎被列為具有高度癌變傾向的疾?。?］。日本學(xué)者Kawai將疣狀胃炎分為成熟型和未成熟型兩種類型［1］，目前得到了廣泛的認(rèn)可。有研究發(fā)現(xiàn)成熟型疣狀胃炎較未成熟型疣狀胃炎具有更強(qiáng)的癌變傾向［5］，但其發(fā)生、發(fā)展和癌變機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

抑癌基因p27定位于人染色體12p13上，其表達(dá)產(chǎn)物p27蛋白是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin dependent kinase inhibitors，CDKI)，為細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子。當(dāng)p27基因突變或失活，喪失或減弱p27蛋白對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用，引起細(xì)胞過(guò)度分裂增殖，最終可導(dǎo)致腫瘤的形成［6］。研究發(fā)現(xiàn)包括胃癌在內(nèi)的絕大部分人類腫瘤均存在p27蛋白表達(dá)下調(diào)或缺失［7～9］，p27蛋白表達(dá)與胃癌的惡性程度以及轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)呈明顯負(fù)相關(guān)，與預(yù)后呈正相關(guān)，說(shuō)明p27參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展［10］。本研究顯示成熟型疣狀胃炎組p27蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于慢性非萎縮性胃炎組和未成熟型疣狀胃炎組，說(shuō)明p27蛋白表達(dá)下調(diào)可能參與了成熟型疣狀胃炎的發(fā)生過(guò)程;p27蛋白在成熟型疣狀胃炎組和胃癌組中的表達(dá)均較低，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明成熟型疣狀胃炎存在p27蛋白的缺失，具有癌變的可能性。

表2 p27蛋白、cyclin D1的表達(dá)與疣狀胃炎患者臨床病理特征的關(guān)系

圖1 各組中p27蛋白表達(dá)(免疫組化二步法，×400)

圖2 各組中cyclin D1表達(dá)(免疫組化二步法，×400)

cyclin D為一種重要的細(xì)胞周期正調(diào)控因子，包括cyclin D1、cyclin D2和cyclin D3三個(gè)亞型，目前以cyclin D1的研究較多見(jiàn)，其與腫瘤的關(guān)系較明確［11］。cyclin D1基因擴(kuò)增及其蛋白高表達(dá)常見(jiàn)于多種人類惡性腫瘤，cyclin D1表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控失衡，使細(xì)胞增殖過(guò)程失控而發(fā)生惡性變化［12］。Gao等［13］的研究發(fā)現(xiàn) cyclin D1 蛋白在胃正常黏膜、增生性息肉和腺瘤中不表達(dá)，僅在胃癌中可檢測(cè)到，且陽(yáng)性表達(dá)的胃癌患者預(yù)后較差。Arici等［14］在43例原發(fā)性胃腺癌患者組織中檢出31例表達(dá)cyclin D1，但正常胃黏膜中不表達(dá)，兩組之間檢出率存在明顯差異，且cyclin D1在萎縮、異型增生、腸化生和胃癌組織中的表達(dá)呈升高趨勢(shì)，提示cyclin D1陽(yáng)性表達(dá)是胃癌的早期事件，其往往始于癌前病變并參與整個(gè)癌變的發(fā)展過(guò)程。本組資料中未成熟型、成熟型疣狀胃炎組cyclin D1陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于慢性非萎縮性胃炎組，但均顯著低于胃癌組。疣狀胃炎可能為胃黏膜組織發(fā)生癌變的中間階段，存在慢性非萎縮性胃炎→疣狀胃炎→胃癌的發(fā)展過(guò)程，cyclin D1可能參與了疣狀胃炎的發(fā)生和癌變過(guò)程。

p27蛋白和cyclin D1均具有對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用，p27蛋白為負(fù)調(diào)控因子，cyclin D1為正調(diào)控因子。本研究中p27蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在慢性非萎縮性胃炎、疣狀胃炎和胃癌中呈遞減趨勢(shì)，而cyclin D1的表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明疣狀胃炎和胃癌中p27蛋白表達(dá)與cyclin D1表達(dá)均無(wú)明顯相關(guān)性，說(shuō)明這兩種蛋白無(wú)明顯拮抗或協(xié)同作用。

本研究發(fā)現(xiàn)疣狀胃炎p27蛋白、cyclin D1表達(dá)與Hp感染無(wú)關(guān)，但與慢性非萎縮性胃炎相比，成熟型和未成熟型疣狀胃炎均具有較高的Hp感染率，而Hp感染與胃癌的發(fā)生有關(guān)，說(shuō)明疣狀胃炎與胃癌的發(fā)生可能有關(guān)。Cappell等［15］發(fā)現(xiàn)疣狀胃炎患者可發(fā)生癌變;姚憶蓉等［16］報(bào)道了4例發(fā)生癌變的疣狀胃炎患者，其中3例在未癌變時(shí)伴有異型增生，另1例伴有腸化生。而本研究發(fā)現(xiàn)未成熟型和成熟型疣狀胃炎均存在一定比例的腸化生和異型增生，且腸化生發(fā)生率顯著高于慢性非萎縮性胃炎組，這兩種病理變化作為胃癌的癌前病變具有較高的癌變率。疣狀胃炎中p27蛋白和cyclin D1的表達(dá)與腸化生有關(guān)，p27蛋白還與異型增生相關(guān)，提示p27蛋白表達(dá)下降和cyclin D1表達(dá)升高可能引起細(xì)胞增殖和分化的紊亂，從而導(dǎo)致腸化生的發(fā)生，且p27蛋白缺失還可使疣狀胃炎胃上皮細(xì)胞過(guò)度增殖、細(xì)胞凋亡受到抑制，引起細(xì)胞發(fā)生異型增生甚至腫瘤性增生。總之，疣狀胃炎較高的Hp感染率、p27蛋白和cyclin D1的異常表達(dá)，均提示疣狀胃炎具有發(fā)展為胃癌的可能性，對(duì)此類患者應(yīng)進(jìn)行密切隨訪。

綜上所述，本研究提示疣狀胃炎具有發(fā)展為胃癌的潛能，p27蛋白和cyclin D1可能在疣狀胃炎的發(fā)生、發(fā)展和癌變過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探討。疣狀胃炎(尤其是成熟型)一經(jīng)內(nèi)鏡檢查發(fā)現(xiàn)應(yīng)行病理活檢，并給予積極治療和密切隨訪。

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