自體熒光內(nèi)鏡診斷消化道惡性腫瘤和癌前病變的臨床初探*

戈之錚 龔 帥 蕭樹東 葉衍銘 鄭家驃 夏敬芳

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所1(200001)上海盛熒光電科技有限公司2

據(jù)統(tǒng)計(jì)，胃癌、結(jié)直腸癌和食管癌分別居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率的第二、三、五位，居病死率的第三、四、五位［1］。目前，上述幾種消化道惡性腫瘤的診斷主要依靠?jī)?nèi)鏡下活檢結(jié)合組織病理學(xué)檢查，因此內(nèi)鏡下發(fā)現(xiàn)病灶并準(zhǔn)確進(jìn)行活檢是消化道惡性腫瘤早期診斷的關(guān)鍵。然而，隨機(jī)活檢存在諸多偶然性，對(duì)于部分早期惡性腫瘤易漏診，對(duì)于部分進(jìn)展期惡性腫瘤如印戒細(xì)胞癌等活檢陽性率不理想。近年來，一些新型內(nèi)鏡技術(shù)不斷應(yīng)用于臨床，除可指導(dǎo)靶向活檢外，還能進(jìn)行實(shí)時(shí)診斷，縮短活檢后組織病理學(xué)檢查的等待時(shí)間。自體熒光內(nèi)鏡應(yīng)用于臨床已十余年，但對(duì)其診斷消化道惡性腫瘤和癌前病變的價(jià)值仍存在較大爭(zhēng)議。本研究采用自主研制的自體熒光內(nèi)鏡對(duì)確診或疑似消化道惡性腫瘤患者或隨訪癌前病變患者的手術(shù)標(biāo)本和在體受試者進(jìn)行檢查，并以組織病理學(xué)檢查結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，旨在探討自體熒光內(nèi)鏡在消化道惡性腫瘤和癌前病變中的診斷價(jià)值。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

第一階段:選取2010年6月～2011年12月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院經(jīng)內(nèi)鏡活檢或影像學(xué)檢查確診或高度懷疑消化道惡性腫瘤而行手術(shù)治療的患者。第二階段:選取2012年1月～2013年3月該院收治的確診或高度懷疑消化道惡性腫瘤患者和隨訪觀察的消化道癌前病變患者。排除標(biāo)準(zhǔn):①具有吞咽困難、精神癥狀等而不能配合檢查者;②肝硬化、腎功能不全、急性消化道出血、凝血功能不全者;③妊娠期和哺乳期婦女;④拒絕簽署知情同意書者。研究方案經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組患者及其家屬簽屬知情同意書。

二、主要儀器設(shè)備和原理

本研究采用自主研制的自體熒光內(nèi)鏡進(jìn)行檢查。該儀器主要由消化道電子內(nèi)鏡、雙光照明光源、視頻分離器、白光圖像處理器、熒光圖像處理器、圖像壓縮器、圖像顯示器等設(shè)備組合而成，工作原理見圖1。在紫光照明的視頻中通過通道“2”和“3”分別記錄組織發(fā)出的紅色、綠色熒光圖像，然后經(jīng)特殊圖像處理方法得到各像點(diǎn)紅、綠光比值(R/G)，最后根據(jù)R/G值大小賦予不同顏色加以顯示。正?；蛄夹越M織R/G值較低，在圖像中呈現(xiàn)綠色;異型增生或癌組織R/G值高于正?；蛄夹越M織，在圖像中呈現(xiàn)紅色。

三、樣本量估計(jì)

設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn) α 為0.05，容許誤差 δ為0.1。前期研究［2］顯示自體熒光光譜診斷胃癌的敏感性和特異性分別為82.9%和91.5%。根據(jù)診斷試驗(yàn)樣本量計(jì)算公式，第一階段達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的最小樣本量應(yīng)為腫瘤病灶54例，非腫瘤病灶30例。第二階段根據(jù)第一階段自體熒光內(nèi)鏡離體診斷的敏感性和特異性進(jìn)行計(jì)算，得出最小樣本量為腫瘤病灶18例，非腫瘤病灶20例。研究中選擇患者自身癌旁正常組織作為對(duì)照。

四、研究方法

1.第一階段:對(duì)納入患者的離體手術(shù)標(biāo)本行自體熒光內(nèi)鏡檢查。新鮮手術(shù)切除標(biāo)本去污后，取癌組織和癌旁正常組織(距病灶邊緣≥5 cm)。將熒光內(nèi)鏡對(duì)準(zhǔn)標(biāo)本中需檢測(cè)的部位，經(jīng)鉗道孔導(dǎo)入光纖，開啟主機(jī)雙光照明功能，內(nèi)鏡顯示屏上同屏顯示檢測(cè)部位真彩色圖像和激發(fā)光照明的熒光偽彩色圖像。對(duì)檢查中發(fā)現(xiàn)的病灶處異常熒光(紅色)和周圍正常組織正常熒光(綠色)區(qū)域標(biāo)本行組織病理學(xué)檢查。

2.第二階段:對(duì)納入患者行在體自體熒光內(nèi)鏡檢查。首先在常規(guī)內(nèi)鏡下對(duì)食管至十二指腸降部進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)病灶后，對(duì)病灶和病灶周圍正常組織(距病灶邊緣≥5 cm)行自體熒光內(nèi)鏡檢查。將熒光內(nèi)鏡在白光照明下插入患者體內(nèi)，通過改變胃鏡前端位置，使其對(duì)準(zhǔn)需檢測(cè)的部位，經(jīng)鉗道孔導(dǎo)入光纖，開啟主機(jī)雙光照明功能，觀察顯示屏上的真彩色圖像和熒光偽彩色圖像。在相應(yīng)檢測(cè)點(diǎn)取活檢行組織病理學(xué)檢查。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用四格表分析計(jì)算自體熒光內(nèi)鏡離體和在體診斷的準(zhǔn)確性、敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值(PPV)和陰性預(yù)測(cè)值(NPV)，計(jì)算95%CI。率和構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗(yàn)。自體熒光內(nèi)鏡與組織病理學(xué)診斷一致性的分析采用κ檢驗(yàn)，κ≥0.75表示一致性較高，0.4＜κ＜0.75表示一致性一般，κ≤0.4表示一致性較低。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 自體熒光內(nèi)鏡工作原理示意圖

結(jié) 果

一、一般資料

第一階段共納入患者170例，其中男103例，女67例，年齡21～86歲;病灶位于食管20例，胃107例，結(jié)直腸43例。第二階段共納入患者30例，其中男25例，女5例，年齡41～84歲;病灶位于食管1例，胃29例。

二、組織病理學(xué)診斷

第一階段患者標(biāo)本中，腫瘤或癌前病變159例(腺癌99例，印戒細(xì)胞癌36例，惡性間質(zhì)瘤4例，鱗癌17例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例，輕度異型增生1例，重度異型增生1例)，其中癌前病變和早期癌17例，進(jìn)展期癌142例;腺癌和印戒細(xì)胞癌中，分化型癌97例，未分化型癌38例。良性病灶11例，其中消化道潰瘍4例，萎縮性胃炎5例，食管糜爛1例，橫結(jié)腸腺瘤性息肉1例。170例癌旁正常組織均無異常表現(xiàn)。

第二階段患者標(biāo)本中，腫瘤或癌前病變26例(腺癌18例，印戒細(xì)胞癌4例，鱗癌1例，淋巴瘤1例，輕度異型增生2例);腺癌和印戒細(xì)胞癌中，分化型癌17例，未分化型癌5例。良性病灶4例，均為慢性炎癥。30例癌旁正常組織均無異常表現(xiàn)。

三、自體熒光內(nèi)鏡診斷

兩階段分別獲得340、60幅自體熒光內(nèi)鏡檢查圖像，其中病灶組織200幅，癌旁正常組織200幅。第一階段159例腫瘤或癌前病變標(biāo)本中，151例呈異型增生或癌組織特征圖像(紅色)，8例未檢出(腺癌2例，印戒細(xì)胞癌5例，鱗癌1例)，呈正常或良性組織特征圖像(綠色);11例良性病灶標(biāo)本中，9例呈綠色圖像，2例呈紅色圖像;170例癌旁正常組織標(biāo)本中，8例呈紅色圖像，162例呈綠色圖像。第二階段26例腫瘤或癌前病變標(biāo)本中，24例呈紅色圖像，2例未檢出(腺癌1例，印戒細(xì)胞癌1例)，呈綠色圖像;4例良性病灶標(biāo)本中，1例呈綠色圖像，3例呈紅色圖像;30例癌旁正常組織標(biāo)本中，1例呈紅色圖像，29例呈綠色圖像。圖像觀察發(fā)現(xiàn)癌組織熒光強(qiáng)弱與腫瘤分化程度密切相關(guān)，分化程度越高，熒光越強(qiáng)，圖像中紅偽顏色越深;分化程度越低，熒光越弱，圖像中紅偽顏色越淺，甚至檢測(cè)不出(見圖2、圖3)。

自體熒光內(nèi)鏡離體和在體診斷消化道惡性腫瘤和癌前病變的準(zhǔn)確性、敏感性、特異性、PPV和NPV見表1，兩種方法上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。將兩組數(shù)據(jù)綜合，結(jié)果顯示自體熒光內(nèi)鏡診斷消化道惡性腫瘤和癌前病變的總體準(zhǔn)確性、敏感性、特異性、PPV和NPV分別為94.0%(95%CI:92.0% ～ 96.6%)、94.6%(95%CI:90.0% ～ 97.2%)、93.5%(95% CI:89.1% ～96.3%)、92.6%(95%CI:87.6% ～ 95.7%)和95.3%(95%CI:91.2% ～97.6%)。自體熒光內(nèi)鏡與組織病理學(xué)診斷結(jié)果一致性較高，κ=0.880(95%CI:0.829 ～0.925)，其中離體診斷 κ =0.894(95%CI:0.845 ～ 0.941)，在體診斷 κ =0.798(95%CI:0.615 ～0.933)。

圖2 胃體印戒細(xì)胞癌組織(低分化)和癌旁正常組織自體熒光內(nèi)鏡檢查圖像

圖3 胃體腺癌組織(高分化)和癌旁正常組織自體熒光內(nèi)鏡檢查圖像

表1 離體和在體自體熒光內(nèi)鏡檢查對(duì)消化道惡性腫瘤和癌前病變?cè)\斷價(jià)值的比較%(95%CI)

自體熒光內(nèi)鏡離體診斷對(duì)癌前病變和早期癌的檢出率為88.2%(15/17)，進(jìn)展期癌為 95.8%(136/142)，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.395，P=0.238);對(duì)分化型癌的檢出率為97.9%(95/97)，未分化型癌為86.8%(33/38)，兩者差異顯著(χ2=6.838，P=0.009)。自體熒光內(nèi)鏡在體診斷對(duì)分化型癌的檢出率為94.1%(16/17)，未分化型癌為80.0%(4/5)，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.794，P=0.373)。

討 論

人體組織表面經(jīng)紫外光或短波長(zhǎng)光(400～500 nm)照射后，組織中的原子或分子由激發(fā)態(tài)躍遷返回至基態(tài)時(shí)會(huì)發(fā)出較激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的熒光，稱為自體熒光［3］。人體內(nèi)自體熒光物質(zhì)主要有膠原、彈性蛋白、色氨酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、血卟啉衍生物等［4］。不同組織的熒光物質(zhì)組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)不同，因而具有獨(dú)特的光學(xué)特性和光譜特征。胃腸道由于黏膜層次復(fù)雜，不同熒光基團(tuán)分布廣泛，自體熒光光譜交錯(cuò)重疊，分類檢測(cè)較為困難［5］。然而，正常組織與腫瘤組織的自體熒光波長(zhǎng)在510 nm和630 nm處有明顯差異［6］。根據(jù)不同組織的熒光光譜發(fā)射特征來區(qū)分組織類型，是自體熒光內(nèi)鏡診斷消化道惡性腫瘤的理論基礎(chǔ)。

消化道惡性腫瘤和癌前病變的確診主要依靠消化內(nèi)鏡下觀察以及活檢結(jié)合組織病理學(xué)檢查。消化道早期和進(jìn)展期惡性腫瘤預(yù)后完全不同，早期胃癌5年生存率＞90%［7］，而晚期胃癌5年生存率僅為10% ～20%［8］。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者不斷將諸如窄帶成像、共聚焦激光成像、自體熒光光譜等新技術(shù)引入消化內(nèi)鏡診斷學(xué)，以期提高消化道早期癌的診斷率。目前，國(guó)外已有三家公司將熒光內(nèi)鏡商業(yè)化，包括加拿大Xillix公司的LIFE-GI、德國(guó)Storz公司的D-Light和日本Olympus公司的AFI等系統(tǒng)。本研究所采用的自主研制的自體熒光內(nèi)鏡采用針對(duì)性強(qiáng)的單一波長(zhǎng)激光作為激發(fā)光源，以雙特征熒光比值成像技術(shù)捕捉熒光圖像，對(duì)生物組織自體熒光強(qiáng)度和色彩的分辨率顯著優(yōu)于上述幾種熒光內(nèi)鏡。癌變組織與正常組織自體熒光強(qiáng)度和色彩的微小差異在傳統(tǒng)光學(xué)成像系統(tǒng)中很難分辨，且內(nèi)鏡在體內(nèi)檢查過程中很難與檢測(cè)部位保持固定距離，而通過內(nèi)鏡傳輸?shù)娜肷浼ぐl(fā)光的能量卻與其距離的平方成反比，在不同位置檢測(cè)時(shí)入射激發(fā)光的能量波動(dòng)很大，從而使檢測(cè)到的熒光強(qiáng)弱有很大變化。利用異型增生或癌組織紅色熒光與正常或良性組織綠色熒光的相對(duì)比例因子不變的特點(diǎn)，采用雙特征熒光比值成像技術(shù)將上述微小差異以不同偽彩色表示，這些差異將更易被穩(wěn)定識(shí)別。另一方面，該熒光內(nèi)鏡采用單一圖像傳感器，以25幀/s的近乎動(dòng)態(tài)速度掃描觀察部位，一旦熒光偽彩色圖像中出現(xiàn)紅色像點(diǎn)，即可對(duì)當(dāng)前位置進(jìn)行定格，根據(jù)定格后的圖像可實(shí)時(shí)分析癌變病灶和癌旁組織特征。本研究通過離體和在體檢測(cè)，探討自體熒光內(nèi)鏡診斷消化道惡性腫瘤和癌前病變的價(jià)值，結(jié)果顯示自體熒光內(nèi)鏡診斷的總體準(zhǔn)確性、敏感性和特異性高達(dá) 94.0%、94.6%和 93.5%，與 Kobayashi等［9］的研究結(jié)果相似，且診斷特異性略高(93.5%對(duì)86.0%)。離體診斷的各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)雖高于在體診斷，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與在體組織中黏液和其他雜質(zhì)對(duì)熒光激發(fā)產(chǎn)生不良影響有關(guān)。癌前病變和早期癌與進(jìn)展期癌的檢出率亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與前者樣本量較少有關(guān)，尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)分化型癌的紅偽顏色較未分化型癌深，與分化型癌的檢出率高于未分化型癌相符。Abe等［10］采用自體熒光內(nèi)鏡成像系統(tǒng) LIFE-GI對(duì)61例胃癌手術(shù)標(biāo)本的429處部位進(jìn)行分析，結(jié)果表明熒光內(nèi)鏡的胃癌檢出率與腫瘤浸潤(rùn)深度和黏膜增厚程度呈正比，對(duì)分化型胃癌診斷率較高，但不適用于診斷黏膜增厚不明顯且呈彌漫性浸潤(rùn)的未分化型胃癌，此結(jié)論與本研究結(jié)果一致。分析認(rèn)為，其原因可能是未分化型癌細(xì)胞分化能力差、體積小、幾乎不形成腺體結(jié)構(gòu)，印戒細(xì)胞癌等黏液腺癌的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿大量黏液，上述因素可能對(duì)自體熒光產(chǎn)生不良影響。此外，未分化型癌中微血管數(shù)量減少，腫瘤組織中最常見的熒光基團(tuán)血卟啉的主要載體血紅蛋白含量相應(yīng)減少，導(dǎo)致自體熒光內(nèi)鏡檢查產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

本研究中兩個(gè)階段的試驗(yàn)均證實(shí)自體熒光內(nèi)鏡具有較高的敏感性，但其易受體內(nèi)正常組織自身雜散光干擾，強(qiáng)雜散光會(huì)降低系統(tǒng)測(cè)量的信噪比，甚至發(fā)生測(cè)量結(jié)果失誤，導(dǎo)致系統(tǒng)采集的熒光圖像顏色偏差，最終造成圖像數(shù)據(jù)處理結(jié)果失實(shí)，產(chǎn)生假陽性、假陰性結(jié)果。

本研究尚存在一定缺陷，第一階段癌前病變和早期癌樣本量較少，導(dǎo)致進(jìn)展期癌比例偏高，對(duì)兩者檢出率的差異產(chǎn)生影響;第二階段在體研究病例數(shù)雖達(dá)到最小樣本量要求，但對(duì)于新研制的自體熒光內(nèi)鏡的臨床驗(yàn)證顯然不足;兩階段均包含診斷明確的病例，對(duì)最終研究結(jié)果可能產(chǎn)生部分偏倚。此外，自體熒光內(nèi)鏡的圖像質(zhì)量和抗干擾性能仍有待進(jìn)一步提高。因此，未來需開展更多研究以探討自體熒光內(nèi)鏡對(duì)不同病理類型、分期、部位消化道腫瘤的檢出率，尤其是大規(guī)模多中心、隨機(jī)、對(duì)照研究。

綜上所述，本研究證實(shí)采用自主研制的自體熒光內(nèi)鏡通過偽彩色熒光成像能夠準(zhǔn)確、客觀地反映消化道惡性腫瘤和癌前病變與正常組織的差異，且較少依賴內(nèi)鏡醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)，具有較高的診斷價(jià)值，同時(shí)亦可用于估計(jì)病變范圍和指導(dǎo)靶向活檢，有望成為診斷早期消化道惡性腫瘤的重要手段。

1 郝杰，陳萬青主編.2012中國(guó)腫瘤登記年報(bào)［M］.北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2012:26-37.

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