外源性膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對慢傳輸型便秘大鼠腸道傳輸功能的影響*

張 興 范一宏 李延玲 呂 賓 張 璐

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科(310006)

慢傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)是一種以結(jié)腸動力障礙為主要特點的頑固性便秘。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快、飲食結(jié)構(gòu)的改變、人口老齡化問題的出現(xiàn)，STC發(fā)病率逐年上升，已成為影響人們生活質(zhì)量的常見疾病之一。呂賓等［1］的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)生長因子及其受體在結(jié)腸中的異常表達(dá)促進(jìn)腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，引起腸壁神經(jīng)叢病理改變，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)腸動力異常。本研究通過大黃灌胃建立STC大鼠模型，旨在探討外源性膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)對STC大鼠結(jié)腸組織中的GDNF表達(dá)及其腸道傳輸功能的影響。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑、儀器

清潔級Sprague-Dawley大鼠48只，7～8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供。大黃(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供);重組人 GDNF(美國 PeproTech公司);兔抗大鼠GDNF多克隆抗體、二抗試劑、濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)(德國Carl Zeiss公司)。

二、實驗方法

1.STC動物模型建立:48只大鼠分為對照組(n=22)和模型組(n=26)，模型組大鼠給予大黃灌胃。參照文獻(xiàn)［1］和預(yù)實驗結(jié)果，大黃起始劑量為200 mg/kg，以 2 mL 0.9%NaCl溶液稀釋為藥物混懸液灌胃，第2 d起每天在前1 d的基礎(chǔ)上增加200 mg/kg，直至半數(shù)大鼠出現(xiàn)稀便，此后維持該劑量直至80%的大鼠稀便消失，再在此基礎(chǔ)上每天依次遞增200 mg/kg，直至半數(shù)大鼠出現(xiàn)稀便，如此循環(huán)給藥3.5個月，最后一次80%的大鼠稀便消失1周后停止給藥。大黃用量為2000 mg/kg時首次出現(xiàn)半數(shù)大鼠致瀉，大黃最終用量為3200 mg/kg。對照組大鼠同期給予2 mL 0.9%NaCl溶液灌胃。

2.實驗分組:造模成功后，模型組大鼠隨機(jī)分為STC模型組和模型GDNF組，對照組大鼠隨機(jī)分為正常對照組和GDNF對照組。GDNF對照組和模型GDNF組按每只2 mL/d(10 ng/mL)的劑量經(jīng)尾靜脈注射重組人GDNF，正常對照組和STC模型組按每只2 mL/d的劑量經(jīng)尾靜脈注射0.9%NaCl溶液，連續(xù)7 d。

3.墨汁推進(jìn)實驗測定大鼠腸道傳輸功能:注射GDNF或0.9%NaCl溶液7 d后，大鼠禁食24 h，經(jīng)口灌入墨汁2 mL，40 min后以3%戊巴比妥鈉0.15 mL/100 mg腹腔注射麻醉后處死，立即剖腹取幽門至直腸末段腸道，在無張力情況下測量腸管總長度和黑染腸管長度，計算腸道推進(jìn)率(黑染腸管長度/腸管總長度×100%)。

4.免疫組化法檢測GDNF表達(dá)量:大鼠處死后取中上段結(jié)腸組織1 cm，采用免疫組化二步法檢測結(jié)腸組織GDNF表達(dá)量，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。GDNF免疫組化染色陽性物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀，定位于細(xì)胞質(zhì)。采用細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)，每張切片選取10個高倍視野(×400)，圖像采集后測定陽性染色面積和積分光密度(IOD)值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

造模過程中，模型組大鼠死亡4只，3只系灌胃不當(dāng)致死，1只系外傷致死，對照組無大鼠死亡;模型組大鼠體質(zhì)量增長較對照組大鼠緩慢(見圖1)，毛發(fā)無光澤，行動遲緩，精神不振，易激惹。造模結(jié)束后，模型組大鼠糞便成形，色深，堅硬，少許呈羊糞狀，部分成形便軟，濕潤黏膩，附著于肛門。對照組大鼠糞便成形，色深，軟硬適中，無肛門附著。

圖1 造模過程中模型組與對照組大鼠體質(zhì)量增長情況比較

二、腸道大體病理改變

各組大鼠腸道外觀無明顯差別，腸管無僵硬、變形、狹窄等病變，結(jié)腸黏膜無色素沉著。與正常對照組和GDNF對照組相比，STC模型組大鼠腸壁變薄，伸縮功能減弱，恢復(fù)自由伸展所需時間明顯延長。

三、腸道傳輸功能

STC模型組腸道推進(jìn)率與正常對照組和GDNF對照組相比顯著降低(P＜0.01)。模型GDNF組腸道推進(jìn)率與STC模型組相比顯著升高(P＜0.01)，與正常對照組和GDNF對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠腸道推進(jìn)率比較()

表1 各組大鼠腸道推進(jìn)率比較()

*與正常對照組比較，P ＜0.01;#與 STC 模型組比較，P ＜0.01

四、結(jié)腸組織GDNF表達(dá)

結(jié)腸組織GDNF陽性細(xì)胞主要分部于肌間神經(jīng)叢，少量分部于黏膜下神經(jīng)叢。STC模型組GDNF陽性面積和IOD值與正常對照組和GDNF對照組相比顯著降低(P＜0.01)。模型GDNF組GDNF陽性面積和IOD值與STC模型組相比顯著升高(P＜0.01)，與正常對照組和GDNF對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(見圖2、表2)。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織GDNF表達(dá)情況比較()

表2 各組大鼠結(jié)腸組織GDNF表達(dá)情況比較()

*與正常對照組比較，P＜0.01;#與 STC模型組比較，P ＜0.01

討 論

STC是由各種因素引起的結(jié)腸運(yùn)動遲緩、糞便傳輸能力下降的頑固性便秘，以無便意、排便次數(shù)減少、腹脹、腹痛等癥狀為主要臨床表現(xiàn)，其結(jié)腸動力障礙與腸神經(jīng)系統(tǒng)異常密切相關(guān)［2，3］。臨床上大部分STC患者有長期服用大黃、番瀉葉、酚酞等接觸性瀉劑史，因而造成結(jié)腸動力障礙，對瀉劑反應(yīng)性下降并產(chǎn)生依賴性，稱為“瀉劑結(jié)腸”［4，5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸壁神經(jīng)叢的病理改變是瀉劑結(jié)腸的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。大黃是一種傳統(tǒng)中藥，具有泄下、健胃、清熱、解毒等功效。本研究予大鼠大黃灌胃造模3.5個月后，大鼠腸道傳輸功能明顯減弱，STC模型制備成功。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織GDNF表達(dá)情況(免疫組化二步法，×400)

GDNF對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和營養(yǎng)具有重要意義，可促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞存活，預(yù)防損傷、毒素以及病理性改變導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞退行性病變［7，8］。胃腸道中的GDNF主要分布于黏膜肌層，在結(jié)腸組織中的表達(dá)水平顯著高于其他胃腸道組織，提示GDNF對結(jié)腸肌層神經(jīng)分布以及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞功能具有重要影響［9］。本研究結(jié)果顯示，STC模型組和正常對照組大鼠腸壁肌間神經(jīng)叢中均存在GDNF表達(dá)，但STC模型組的GDNF表達(dá)顯著低于正常對照組，提示長期使用大黃會導(dǎo)致大鼠腸壁組織中的GDNF表達(dá)減少，而GDNF表達(dá)減少參與了腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元細(xì)胞的退化變性，導(dǎo)致結(jié)腸動力障礙。本研究中，給予STC模型組大鼠外源性GDNF治療后，其腸壁組織GDNF表達(dá)顯著升高，腸道傳輸功能明顯改善，提示外源性GDNF可上調(diào)腸壁組織GDNF表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸壁神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，改善結(jié)腸動力。

綜上所述，外源性GDNF可明顯改善STC大鼠的腸道傳輸功能，提示其可能用于臨床STC患者的治療。但GDNF作為一種大分子蛋白質(zhì)，難以透過血腦屏障且易在體內(nèi)降解，使其臨床應(yīng)用受到限制。尋找促進(jìn)內(nèi)源性GDNF釋放的有效途徑，可能為STC的臨床治療提供新的方法，有待日后深入研究。

1 呂賓，王梅，范一宏，等.大鼠瀉劑結(jié)腸腸壁神經(jīng)生長因子及受體表達(dá)的研究［J］.中華消化雜志，2004，24(11):684-687.

2 Voderholzer WA，Wiebecke B，Gerum M，et al.Dysplasia of the submucous nerve plexus in slow-transit constipation of adults［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol，2000，12(7):755-759.

3 Wedel T，Roblick UJ，Ott V，et al.Oligoneuronal hypoganglionosis in patients with idiopathic slow-transit constipation［J］.Dis Colon Rectum，2002，45(1):54-62.

4 Nadal SR，Calore EE，Manzione CR，et al.Effects of long-term administration of Senna occidentalis seeds in the large bowel of rats［J］.Pathol Res Pract，2003，199(11):733-737.

5 孟健，劉寶華，鄭仲謹(jǐn).大鼠“瀉劑結(jié)腸”模型的動力學(xué)研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2003，32(3):332-333.

6 王梅，呂賓，范一宏，等.刺激性瀉劑對大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2005，25(5):434-436.

7 Peterziel H，Unsicker K，Krieglstein K.TGFbeta induces GDNF responsiveness in neurons by recruitmentof GFRalpha1 to the plasma membrane［J］.J Cell Biol，2002，159(1):157-167.

8 Hsu YC，Lee DC，Chiu IM.Neural stem cells，neural progenitors，and neurotrophic factors［J］.Cell Transplant，2007，16(2):133-150.

9 Wartiovaara K，Salo M，Sainio K，et al.Distribution of glial cell line-derived neurotrophic factor mRNA in human colon suggests roles for muscularis mucosae in innervation［J］. J Pediatr Surg，1998，33(10):1501-1506.