蘆丁合鐵（Ⅲ）的合成、表征及其與DNA相互作用研究

李艾華，郭艷華，張玉敏

（江漢大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430056）

蘆丁是存在于植物中的一種黃酮類化合物，廣泛用于醫(yī)藥、保健食品中［1-3］。蘆丁具有降低毛細(xì)血管通透性、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗氧化及抑制醛糖還原酶等藥理活性。近年來，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道蘆丁具有抗癌作用［4］，蘆丁具有3'，4'位二羥基和4-羰基-5-羥基，與金屬離子可螯合成穩(wěn)定的五元環(huán)或六元環(huán)［5］。研究表明，許多有機(jī)分子配體與金屬配合形成配合物后，其藥效明顯增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)蘆丁合鐵配合物可以增強(qiáng)蘆丁保護(hù)細(xì)胞抗損傷的能力及對抗炎癥作用。蘆丁合鐵（Ⅲ）配合物的體外清除氧自由基的能力為單純蘆丁的2～30倍，蘆丁合鐵（Ⅲ）配合物能夠有效對抗博萊霉素誘導(dǎo)的肺水腫［6］。

眾所周知，DNA是生物體的重要組成物質(zhì)，是遺傳信息的攜帶者和基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，它在生物的生長、發(fā)育和繁殖等活動(dòng)中具有十分重要的作用。DNA的結(jié)構(gòu)直接影響其功能，并與致癌、抗癌有關(guān)。研究小分子金屬配合物和DNA的相互作用，從而探索DNA的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，將有助于人們從分子水平上了解生命現(xiàn)象的本質(zhì)，并從基因水平上理解遺傳病、癌癥、艾滋病等疾病的發(fā)病機(jī)理，使通過分子設(shè)計(jì)尋找有效的治療藥物成為可能。鈷、銅、鋅、銪等元素的蘆丁配合物與DNA相互作用的研究已有報(bào)道［7-9］，而鐵與DNA相互作用的研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)合成了蘆丁合鐵配合物，利用紅外、紫外、差熱-熱重分析等方法對合成的蘆丁合鐵進(jìn)行了檢測，并對蘆丁合鐵與DNA的作用進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

蘆?。˙R）、DNA（BR 批號 F20091118）、無水乙醇（AR）均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸鐵（AR）購于天津市福晨市化學(xué)試劑廠；Ethidium Brmide（BR純度≥98%）購于上海索萊寶生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

UV-2550紫外可見分光光度計(jì)，日本島津；FTIR-8000型紅外光譜儀，日本島津；LS-55熒光分光光度計(jì)，美國Perkin Elmer公司；CRY-2P型差熱分析儀，北京光學(xué)儀器廠；JJ-1型定時(shí)電動(dòng)攪拌器，江蘇金壇中大儀器廠；DF110型電子分析天平，中國輕工業(yè)機(jī)械總公司常熟衡器工業(yè)公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-2國華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁合鐵配合物的合成 根據(jù)蘆丁合鐵配合物的合成條件，按下列較優(yōu)方法合成：將1.4 g（約2 mmo1）蘆丁與40 mL無水乙醇投入到250 mL三口燒瓶中，微熱使其完全溶解，再加入0.4 g無水碳酸鈉攪拌1 h，即有黃色的蘆丁鈉鹽生成，再將0.4 g（約1 mmo1）硫酸鐵加入到三口燒瓶中，同時(shí)滴加約10 mL濃度為0.5 mol/L的醋酸溶液調(diào)pH至弱酸性，然后在40℃的恒溫水浴鍋中加熱回流攪拌4 h，即得到大量棕黑色沉淀，靜置、冷卻、抽濾，沉淀用95%乙醇洗滌數(shù)次，室溫真空干燥，最后得深棕色粉末狀固體，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蘆丁合鐵組成與結(jié)構(gòu)的表征 配位比的測定采用等摩爾連續(xù)變化法：固定緩沖溶液的用量為2.0 mL，金屬離子和蘆丁溶液（濃度均為1.0 mmol/L）的總量為8.0 mL，連續(xù)改變兩種組分的體積，在40℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h，反應(yīng)完畢后測溶液在416 nm處的吸光度，并對蘆丁體積作圖。

紫外吸收光譜測定：選擇合適的參比溶液，在200～700 nm范圍掃描樣品溶液的紫外可見吸收光譜圖。掃描速度為500 nm/min，分辨率為0.02 nm。

差熱-熱重分析測定：取3.6 mg蘆丁合鐵放入CRY-2P型差熱分析儀中，在N2氣氛中，升溫速度為20℃/min，測定范圍為20～700℃ 條件下，繪制其TG-DTA-DTG曲線圖。

紅外光譜測定：KBr壓片，在400～4000 cm-1區(qū)間范圍內(nèi)掃描其紅外光譜。

1.2.3 蘆丁合鐵與DNA作用的光譜表征 熒光光譜測定：在10 mL比色管中加入26.7 mg/25 mL DNA溶液0.05 mL，1.0 mg/mL EB溶液0.4 mL，再分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的蘆丁合鐵（36.7 mg/50 mL），用二次蒸餾水稀釋至刻度，避光作用1 h后，在激發(fā)波長為356 nm、激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫為10 nm的條件下掃描其發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁合鐵組成的測定

圖1即為用等摩爾連續(xù)變化法測配位比的曲線。由圖1可見，當(dāng)Ru和Fe（Ⅲ）體積比（即摩爾比）約為2∶1時(shí)吸光度最大，說明蘆丁合鐵配合物的組成約為Ru∶Fe（Ⅲ）=2∶1。

圖2為蘆丁合鐵的TG-DTA-DTG曲線圖，由圖2可見，熱重曲線在開始時(shí)也有由于氣流不穩(wěn)所致的鼓起部分，在54℃左右有一吸熱峰，是由于蘆丁合鐵配合物失去結(jié)晶水所致，對應(yīng)于熱失重曲線，失重率為6.94%，推測結(jié)晶水分子數(shù)為5；在261℃處有一吸熱峰，為配合物的分子結(jié)構(gòu)被破壞而引起分解所致，對應(yīng)于熱失重曲線，失重率為18.33%，最后剩余81.67%可能為未完全分解的蘆丁和Fe2O3的質(zhì)量。

圖1 蘆丁合鐵配位比的測定

結(jié)合以上配位比組成的測定和差熱與熱重分析的數(shù)據(jù)，可以推測出合成的蘆丁合鐵配合物分子式可能為Fe（Rutin）2·5H2O。

圖2 蘆丁合鐵的TG-DTA-DTG曲線

2.2 紫外-可見光譜分析

分別稱取0.0260 g蘆丁、0.0367 g蘆丁合鐵，用95%乙醇定容至100 mL。用95%乙醇作參比，在200～700 nm范圍掃描其吸收光譜，光譜圖見圖3所示。

圖3 蘆丁及其配合物在95%乙醇溶液中的紫外吸收光譜圖

蘆丁在乙醇溶液中的特征吸收波長為258 nm、360 nm，形成配合物后兩個(gè)峰帶分別紅移了4 nm和56 nm。譜帶的移動(dòng)證明了配合物的生成，而譜帶之所以移動(dòng)是因?yàn)樾纬膳浜衔镏?，整個(gè)分子中電子的離域程度增大，致使電子躍遷時(shí)需要的能量降低，從而使吸收峰發(fā)生紅移。

2.3 紅外光譜分析

紅外光譜是由于分子中基團(tuán)原子間振動(dòng)躍遷時(shí)吸收紅外光所產(chǎn)生的，紅外光譜主要用于定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析。表1為蘆丁及其配合物的紅外光譜數(shù)據(jù)，配體蘆丁在1655 cm-1處出現(xiàn)羰基伸縮振動(dòng)吸收峰，蘆丁合鐵形成配合物后向低頻方向移動(dòng)了約31 cm-1，表明蘆丁4位羰基參與了配合反應(yīng)。蘆丁合鐵在620.94 cm-1處出現(xiàn)了Fe-O鍵的特征吸收峰，而該吸收峰在蘆丁的紅外波譜圖中沒有出現(xiàn)，可見金屬離子與配體發(fā)生了絡(luò)合。蘆丁在1504.76 cm-1處出現(xiàn)的峰為苯環(huán)π鍵共軛體系的（C=C）鍵伸縮振動(dòng)峰，在配合物中此峰向低波數(shù)移動(dòng)了30.43 cm-1，這是配位反應(yīng)對苯環(huán)共軛體系影響所致。另外，蘆丁在1298.10 cm-1處的C-O伸縮振動(dòng)移至1271.21 cm-1，這些現(xiàn)象也說明由于金屬離子的配位作用發(fā)生偏移，從而產(chǎn)生吸收峰的位移。

表1 紅外光譜數(shù)據(jù)/cm-1

2.4 配合物與DNA作用的電子吸收光譜分析

在10 mL比色管中加入27.8 mg/50 mL蘆丁合鐵2 mL，再分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的26.7 mg/25 mL DNA溶液，用二次蒸餾水稀釋至刻度，掃描紀(jì)錄紫外光譜（見圖4）。從圖4中看出DNA的加入使蘆丁合鐵配合物的吸收光譜發(fā)生了變化，隨著DNA濃度的增加，譜圖有明顯的增色效應(yīng)，吸收峰的位置紅移了10 nm左右，紅移是由蘆丁合鐵分子嵌入DNA雙鏈中，蘆丁合鐵的π*共軛體系與DNA堿基的大π共軛體系之間發(fā)生較強(qiáng)的相互作用，產(chǎn)生π電子堆積，其π*空軌道與堿基的π電子軌道發(fā)生偶合，能使級下降，導(dǎo)致π*—π躍遷能減?。?0］。這說明蘆丁合鐵與DNA確實(shí)發(fā)生了作用。

2.5 配合物與EB的競爭性結(jié)合研究

圖4 蘆丁合鐵及其與DNA作用后的吸收光譜

EB是一種熒光試劑，它本身的熒光很弱，但嵌入雙鏈DNA的堿基之間后使本身熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。如果小分子配合物也能與DNA發(fā)生類似的嵌入作用，則這個(gè)小分子競爭EB與DNA的結(jié)合位點(diǎn)，使體系的熒光強(qiáng)度減弱。通常，當(dāng)EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度減弱50%，且c（配合物）/c（DNA）＜100時(shí)，就認(rèn)為該小分子配合物與DNA發(fā)生了類似于EB的嵌入作用［11］。

圖5即為加入不同量的蘆丁合鐵后EB-DNA的熒光光譜。由圖5可知，當(dāng)c（蘆丁合鐵）/c（DNA）=5.50時(shí)，EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度已降到原來的50%以下，說明蘆丁合鐵發(fā)生了類似于EB的嵌入作用。隨著蘆丁合鐵的加入，它取代了EB-DNA體系中相當(dāng)數(shù)量的EB分子，導(dǎo)致了EB-DNA體系熒光強(qiáng)度的較大降低。

圖5 蘆丁合鐵-EB-DNA體系的熒光光譜

2.6 熒光猝滅方式判斷

根據(jù)經(jīng)典的熒光猝滅理論，無論靜態(tài)猝滅或動(dòng)態(tài)猝滅，體系相對熒光強(qiáng)度F0/F（F0為未加入配合物的EB-DNA體系熒光值，F(xiàn)為加入配合物的EB-DNA體系的熒光值），對配合物濃度［Q］作圖均應(yīng)得到一條直線［12］（見圖6）。由圖6可知熒光強(qiáng)度F0/F與配合物濃度呈線性關(guān)系，根據(jù)Stem-Volmer方程F0/F=l+kq[Q]，得出蘆丁合鐵與DNA的鍵合常數(shù)為67.57 mL/mg，相關(guān)系數(shù)R=0.9923，說明蘆丁合鐵嵌入DNA雙鏈中取代已嵌入的EB分子。

圖6 蘆丁合鐵對EB-DNA體系的熒光猝滅

3 結(jié)語

筆者合成了蘆丁合鐵配合物，結(jié)合UV中的等摩爾連續(xù)變化法和TG-DTA等手段初步確定其可能的分子式為Fe（Rutin）2·5H2O，并對配合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征；運(yùn)用吸收光譜、熒光發(fā)射光譜等方法研究了配合物與DNA的作用機(jī)理，并計(jì)算出鍵合常數(shù)為67.57 mL/mg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蘆丁合鐵與DNA以嵌入模式結(jié)合。

［1］韓英華，秦元璋.蘆丁研究現(xiàn)狀［J］.山東中醫(yī)雜志，2003，22（10）：635-637.

［2］李茂星，謝景文，葛欣.蘆丁的藥學(xué)研究進(jìn)展［J］.華西藥學(xué)雜志，2000，15（6）：450-451.

［3］龍全江，楊韜.蘆丁的研究概況及展望［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2002，9（4）：39-42.

［4］沈欽海，馬臻，陳國民.蘆丁對HepG2細(xì)胞生長的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28（18）：1885-1887.

［5］劉杰，王伯初，彭亮，等.黃酮類抗氧化劑的構(gòu)-效關(guān)系［J］.重慶大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，27（2）：120-124.

［6］Afanas'eva I B，Ostrakhovitch E A，Mikhal'chik E V，et al.Enhancement of antioxidant and anti-inflammato?ry activities of bioflavonoid rutin by complexation with transition metals［J］.Biochem Pharmacol，2001，61（6）：677-684.

［7］康敬萬，蘇碧泉，盧小泉，等.蘆丁配合物的合成、表征及其與DNA作用的電化學(xué)研究［J］.西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，42（1）：54-57.

［8］康敬萬，蘇碧泉，李志峰，等.蘆丁合鈷與DNA相互作用研究［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2006，18（4）：360-364.

［9］康敬萬，吳海霞，卓琳，等.Eu3+—蘆丁配合物與DNA相互作用的電化學(xué)和紫外可見吸收光譜研究［J］.中國稀土學(xué)報(bào)，2005，23（4）：496-500.

［10］王明召，黃鳳仙，徐小燕，等.金屬配合物與DNA的弱相互作用［J］.化學(xué)教育，2008（10）：3-5.

［11］Liu J，Zhang T X，Lu T B，et al.DNA—binding and cleavage studies of macrocycliccopper（II） complexes［J］.J Inorg Biochem，2002，91（1）：269-276.

［12］宋玉民，楊培菊，王流芳，等.全反式維甲酸合釤（Ⅲ）配合物與DNA作用的研究［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2003，61（8）：1266-1270.