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    蘆丁合鐵(Ⅲ)的合成、表征及其與DNA相互作用研究

    2013-10-22 07:24:32李艾華郭艷華張玉敏
    關(guān)鍵詞:吸收光譜蘆丁紅外

    李艾華,郭艷華,張玉敏

    (江漢大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 武漢 430056)

    蘆丁是存在于植物中的一種黃酮類化合物,廣泛用于醫(yī)藥、保健食品中[1-3]。蘆丁具有降低毛細(xì)血管通透性、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗氧化及抑制醛糖還原酶等藥理活性。近年來,國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道蘆丁具有抗癌作用[4],蘆丁具有3',4'位二羥基和4-羰基-5-羥基,與金屬離子可螯合成穩(wěn)定的五元環(huán)或六元環(huán)[5]。研究表明,許多有機(jī)分子配體與金屬配合形成配合物后,其藥效明顯增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)蘆丁合鐵配合物可以增強(qiáng)蘆丁保護(hù)細(xì)胞抗損傷的能力及對抗炎癥作用。蘆丁合鐵(Ⅲ)配合物的體外清除氧自由基的能力為單純蘆丁的2~30倍,蘆丁合鐵(Ⅲ)配合物能夠有效對抗博萊霉素誘導(dǎo)的肺水腫[6]。

    眾所周知,DNA是生物體的重要組成物質(zhì),是遺傳信息的攜帶者和基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ),它在生物的生長、發(fā)育和繁殖等活動(dòng)中具有十分重要的作用。DNA的結(jié)構(gòu)直接影響其功能,并與致癌、抗癌有關(guān)。研究小分子金屬配合物和DNA的相互作用,從而探索DNA的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,將有助于人們從分子水平上了解生命現(xiàn)象的本質(zhì),并從基因水平上理解遺傳病、癌癥、艾滋病等疾病的發(fā)病機(jī)理,使通過分子設(shè)計(jì)尋找有效的治療藥物成為可能。鈷、銅、鋅、銪等元素的蘆丁配合物與DNA相互作用的研究已有報(bào)道[7-9],而鐵與DNA相互作用的研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)合成了蘆丁合鐵配合物,利用紅外、紫外、差熱-熱重分析等方法對合成的蘆丁合鐵進(jìn)行了檢測,并對蘆丁合鐵與DNA的作用進(jìn)行了研究。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    蘆?。˙R)、DNA(BR 批號 F20091118)、無水乙醇(AR)均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硫酸鐵(AR)購于天津市福晨市化學(xué)試劑廠;Ethidium Brmide(BR純度≥98%)購于上海索萊寶生物科技有限公司;其余試劑均為分析純。

    UV-2550紫外可見分光光度計(jì),日本島津;FTIR-8000型紅外光譜儀,日本島津;LS-55熒光分光光度計(jì),美國Perkin Elmer公司;CRY-2P型差熱分析儀,北京光學(xué)儀器廠;JJ-1型定時(shí)電動(dòng)攪拌器,江蘇金壇中大儀器廠;DF110型電子分析天平,中國輕工業(yè)機(jī)械總公司常熟衡器工業(yè)公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋,HH-2國華電器有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 蘆丁合鐵配合物的合成 根據(jù)蘆丁合鐵配合物的合成條件,按下列較優(yōu)方法合成:將1.4 g(約2 mmo1)蘆丁與40 mL無水乙醇投入到250 mL三口燒瓶中,微熱使其完全溶解,再加入0.4 g無水碳酸鈉攪拌1 h,即有黃色的蘆丁鈉鹽生成,再將0.4 g(約1 mmo1)硫酸鐵加入到三口燒瓶中,同時(shí)滴加約10 mL濃度為0.5 mol/L的醋酸溶液調(diào)pH至弱酸性,然后在40℃的恒溫水浴鍋中加熱回流攪拌4 h,即得到大量棕黑色沉淀,靜置、冷卻、抽濾,沉淀用95%乙醇洗滌數(shù)次,室溫真空干燥,最后得深棕色粉末狀固體,保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 蘆丁合鐵組成與結(jié)構(gòu)的表征 配位比的測定采用等摩爾連續(xù)變化法:固定緩沖溶液的用量為2.0 mL,金屬離子和蘆丁溶液(濃度均為1.0 mmol/L)的總量為8.0 mL,連續(xù)改變兩種組分的體積,在40℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h,反應(yīng)完畢后測溶液在416 nm處的吸光度,并對蘆丁體積作圖。

    紫外吸收光譜測定:選擇合適的參比溶液,在200~700 nm范圍掃描樣品溶液的紫外可見吸收光譜圖。掃描速度為500 nm/min,分辨率為0.02 nm。

    差熱-熱重分析測定:取3.6 mg蘆丁合鐵放入CRY-2P型差熱分析儀中,在N2氣氛中,升溫速度為20℃/min,測定范圍為20~700℃ 條件下,繪制其TG-DTA-DTG曲線圖。

    紅外光譜測定:KBr壓片,在400~4000 cm-1區(qū)間范圍內(nèi)掃描其紅外光譜。

    1.2.3 蘆丁合鐵與DNA作用的光譜表征 熒光光譜測定:在10 mL比色管中加入26.7 mg/25 mL DNA溶液0.05 mL,1.0 mg/mL EB溶液0.4 mL,再分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的蘆丁合鐵(36.7 mg/50 mL),用二次蒸餾水稀釋至刻度,避光作用1 h后,在激發(fā)波長為356 nm、激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫為10 nm的條件下掃描其發(fā)射光譜。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蘆丁合鐵組成的測定

    圖1即為用等摩爾連續(xù)變化法測配位比的曲線。由圖1可見,當(dāng)Ru和Fe(Ⅲ)體積比(即摩爾比)約為2∶1時(shí)吸光度最大,說明蘆丁合鐵配合物的組成約為Ru∶Fe(Ⅲ)=2∶1。

    圖2為蘆丁合鐵的TG-DTA-DTG曲線圖,由圖2可見,熱重曲線在開始時(shí)也有由于氣流不穩(wěn)所致的鼓起部分,在54℃左右有一吸熱峰,是由于蘆丁合鐵配合物失去結(jié)晶水所致,對應(yīng)于熱失重曲線,失重率為6.94%,推測結(jié)晶水分子數(shù)為5;在261℃處有一吸熱峰,為配合物的分子結(jié)構(gòu)被破壞而引起分解所致,對應(yīng)于熱失重曲線,失重率為18.33%,最后剩余81.67%可能為未完全分解的蘆丁和Fe2O3的質(zhì)量。

    圖1 蘆丁合鐵配位比的測定

    結(jié)合以上配位比組成的測定和差熱與熱重分析的數(shù)據(jù),可以推測出合成的蘆丁合鐵配合物分子式可能為Fe(Rutin)2·5H2O。

    圖2 蘆丁合鐵的TG-DTA-DTG曲線

    2.2 紫外-可見光譜分析

    分別稱取0.0260 g蘆丁、0.0367 g蘆丁合鐵,用95%乙醇定容至100 mL。用95%乙醇作參比,在200~700 nm范圍掃描其吸收光譜,光譜圖見圖3所示。

    圖3 蘆丁及其配合物在95%乙醇溶液中的紫外吸收光譜圖

    蘆丁在乙醇溶液中的特征吸收波長為258 nm、360 nm,形成配合物后兩個(gè)峰帶分別紅移了4 nm和56 nm。譜帶的移動(dòng)證明了配合物的生成,而譜帶之所以移動(dòng)是因?yàn)樾纬膳浜衔镏?,整個(gè)分子中電子的離域程度增大,致使電子躍遷時(shí)需要的能量降低,從而使吸收峰發(fā)生紅移。

    2.3 紅外光譜分析

    紅外光譜是由于分子中基團(tuán)原子間振動(dòng)躍遷時(shí)吸收紅外光所產(chǎn)生的,紅外光譜主要用于定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析。表1為蘆丁及其配合物的紅外光譜數(shù)據(jù),配體蘆丁在1655 cm-1處出現(xiàn)羰基伸縮振動(dòng)吸收峰,蘆丁合鐵形成配合物后向低頻方向移動(dòng)了約31 cm-1,表明蘆丁4位羰基參與了配合反應(yīng)。蘆丁合鐵在620.94 cm-1處出現(xiàn)了Fe-O鍵的特征吸收峰,而該吸收峰在蘆丁的紅外波譜圖中沒有出現(xiàn),可見金屬離子與配體發(fā)生了絡(luò)合。蘆丁在1504.76 cm-1處出現(xiàn)的峰為苯環(huán)π鍵共軛體系的(C=C)鍵伸縮振動(dòng)峰,在配合物中此峰向低波數(shù)移動(dòng)了30.43 cm-1,這是配位反應(yīng)對苯環(huán)共軛體系影響所致。另外,蘆丁在1298.10 cm-1處的C-O伸縮振動(dòng)移至1271.21 cm-1,這些現(xiàn)象也說明由于金屬離子的配位作用發(fā)生偏移,從而產(chǎn)生吸收峰的位移。

    表1 紅外光譜數(shù)據(jù)/cm-1

    2.4 配合物與DNA作用的電子吸收光譜分析

    在10 mL比色管中加入27.8 mg/50 mL蘆丁合鐵2 mL,再分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的26.7 mg/25 mL DNA溶液,用二次蒸餾水稀釋至刻度,掃描紀(jì)錄紫外光譜(見圖4)。從圖4中看出DNA的加入使蘆丁合鐵配合物的吸收光譜發(fā)生了變化,隨著DNA濃度的增加,譜圖有明顯的增色效應(yīng),吸收峰的位置紅移了10 nm左右,紅移是由蘆丁合鐵分子嵌入DNA雙鏈中,蘆丁合鐵的π*共軛體系與DNA堿基的大π共軛體系之間發(fā)生較強(qiáng)的相互作用,產(chǎn)生π電子堆積,其π*空軌道與堿基的π電子軌道發(fā)生偶合,能使級下降,導(dǎo)致π*—π躍遷能減?。?0]。這說明蘆丁合鐵與DNA確實(shí)發(fā)生了作用。

    2.5 配合物與EB的競爭性結(jié)合研究

    圖4 蘆丁合鐵及其與DNA作用后的吸收光譜

    EB是一種熒光試劑,它本身的熒光很弱,但嵌入雙鏈DNA的堿基之間后使本身熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。如果小分子配合物也能與DNA發(fā)生類似的嵌入作用,則這個(gè)小分子競爭EB與DNA的結(jié)合位點(diǎn),使體系的熒光強(qiáng)度減弱。通常,當(dāng)EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度減弱50%,且c(配合物)/c(DNA)<100時(shí),就認(rèn)為該小分子配合物與DNA發(fā)生了類似于EB的嵌入作用[11]。

    圖5即為加入不同量的蘆丁合鐵后EB-DNA的熒光光譜。由圖5可知,當(dāng)c(蘆丁合鐵)/c(DNA)=5.50時(shí),EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度已降到原來的50%以下,說明蘆丁合鐵發(fā)生了類似于EB的嵌入作用。隨著蘆丁合鐵的加入,它取代了EB-DNA體系中相當(dāng)數(shù)量的EB分子,導(dǎo)致了EB-DNA體系熒光強(qiáng)度的較大降低。

    圖5 蘆丁合鐵-EB-DNA體系的熒光光譜

    2.6 熒光猝滅方式判斷

    根據(jù)經(jīng)典的熒光猝滅理論,無論靜態(tài)猝滅或動(dòng)態(tài)猝滅,體系相對熒光強(qiáng)度F0/F(F0為未加入配合物的EB-DNA體系熒光值,F(xiàn)為加入配合物的EB-DNA體系的熒光值),對配合物濃度[Q]作圖均應(yīng)得到一條直線[12](見圖6)。由圖6可知熒光強(qiáng)度F0/F與配合物濃度呈線性關(guān)系,根據(jù)Stem-Volmer方程F0/F=l+kq[Q],得出蘆丁合鐵與DNA的鍵合常數(shù)為67.57 mL/mg,相關(guān)系數(shù)R=0.9923,說明蘆丁合鐵嵌入DNA雙鏈中取代已嵌入的EB分子。

    圖6 蘆丁合鐵對EB-DNA體系的熒光猝滅

    3 結(jié)語

    筆者合成了蘆丁合鐵配合物,結(jié)合UV中的等摩爾連續(xù)變化法和TG-DTA等手段初步確定其可能的分子式為Fe(Rutin)2·5H2O,并對配合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征;運(yùn)用吸收光譜、熒光發(fā)射光譜等方法研究了配合物與DNA的作用機(jī)理,并計(jì)算出鍵合常數(shù)為67.57 mL/mg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蘆丁合鐵與DNA以嵌入模式結(jié)合。

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