利用大孔樹(shù)脂吸附法分離兒茶素EGCG和咖啡因

王瑞芳，陳發(fā)河，吳光斌，謝遠(yuǎn)紅

(集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建廈門(mén)361021)

0 引言

研究表明，兒茶素EGCG具有顯著的抗氧化性，有助于抗癌、抗誘變、抑制腫瘤、抗病毒、降脂助消化等作用［1-6］.干茶葉中約含20%的兒茶素，3%左右的咖啡因［7］.在兒茶素的提取過(guò)程中，咖啡因也同時(shí)被提取出來(lái)，咖啡因會(huì)刺激中樞神經(jīng)、增加血壓、提高類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患病率等，因此，兒茶素和咖啡因的分離研究備受關(guān)注.目前，兒茶素和咖啡因的分離主要是采用有機(jī)溶劑萃?。?］和金屬離子沉淀法［9］，但這兩種方法對(duì)操作的安全性要求較高，且對(duì)環(huán)境易造成較大影響.研究者對(duì)大孔吸附樹(shù)脂法分離兒茶素和咖啡因已做了大量研究，并篩選出具有較好層析分離效果的吸附樹(shù)脂［10-11］.但他們大多選擇對(duì)兒茶素具有較高吸附容量的吸附樹(shù)脂，先把兒茶素吸附 (咖啡因通常也被吸附)，再通過(guò)一般洗脫或梯度洗脫的方法將兒茶素和咖啡因分離［12-13］.由于茶葉提取液中兒茶素含量較高，而咖啡因含量較低，本文擬選擇一種對(duì)咖啡因具有較高吸附選擇性的樹(shù)脂，在吸附過(guò)程中能將低含量組分咖啡因吸附，而兒茶素流出，達(dá)到分離的目的.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠茶，產(chǎn)地福建;兒茶素EGCG對(duì)照品 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%)、咖啡因?qū)φ掌?(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)均為Sigma公司產(chǎn)品;甲醇 (色譜純);S-8、X-5、XAD-200大孔吸附樹(shù)脂由南開(kāi)大學(xué)化工廠提供.

1.2 儀器與設(shè)備

Angilent 1100高效液相色譜儀;自動(dòng)進(jìn)樣器;紫外監(jiān)測(cè)器 (Angilent);DT-100A型分析天平(北京光學(xué)儀器廠);THZ88-1臺(tái)式多用恒溫振蕩器 (江蘇太倉(cāng)生化儀器廠);HL-2恒流泵 (上海滬西儀器廠);BSZ-2自動(dòng)分部收集器 (上海滬西儀器廠);真空干燥箱 (天津?qū)嶒?yàn)儀器廠).

1.3 預(yù)處理

兒茶素EGCG和咖啡因含量的HPLC測(cè)定、供試液的制備方法、樹(shù)脂預(yù)處理方法參見(jiàn)文獻(xiàn) ［13］.

1.4 靜態(tài)吸附、解吸試驗(yàn)

稱(chēng)取1 g濕樹(shù)脂直接加入50 mL具塞錐形瓶中，再加10 mL供試溶液，塞緊瓶口后置恒溫振蕩器中，25℃振蕩 (140 r/min)吸附24 h后取樣，然后過(guò)濾，少量水快速漂洗，再將樹(shù)脂全部轉(zhuǎn)移至另一干凈干燥錐形瓶中，加10 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇水溶液，塞緊瓶口后置恒溫振蕩器中，25℃振蕩 (140 r/min)解吸24 h后取樣.HPLC法測(cè)定供試液、吸附殘液、解吸液中的兒茶素EGCG和咖啡因的含量，相關(guān)參數(shù)的計(jì)算公式:

其中:C0為供試液中溶質(zhì)的質(zhì)量濃度 (mg/mL);C1為吸附殘液中溶質(zhì)的質(zhì)量濃度 (mg/mL);C2為解吸液中溶質(zhì)的質(zhì)量濃度 (mg/mL);V1為供試液體積 (mL);V2為解吸液體積 (mL);W為樹(shù)脂濕重 (g);x為樹(shù)脂含水量;m為吸附量 (mg/g).

1.5 動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

40 mL XAD-200濕樹(shù)脂裝入內(nèi)徑1.5 cm交換柱，樣品液以1 BV/h上柱，流出液分部收集，同時(shí)對(duì)流出液進(jìn)行HPLC檢測(cè).

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)

分別精確稱(chēng)取兒茶素EGCG和咖啡因的對(duì)照品20 mg和6 mg，置10 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇至刻度，混勻.分別自動(dòng)進(jìn)樣5、10、15、20、25、30 μL，測(cè)定高效液相色譜，其HPLC圖譜如圖1所示，其中，兒茶素EGCG的保留時(shí)間為19.218 min，咖啡因的保留時(shí)間為18.181 min.以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，EGCG:Y=8.91909 X-198.19052，R=0.99985;咖啡因:Y=14.5217 X-535.35714，R=0.99978.計(jì)算結(jié)果顯示，在檢測(cè)范圍線(xiàn)性均良好，EGCG及咖啡因的定量計(jì)算均以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為計(jì)算依據(jù).

圖1 兒茶素EGCG對(duì)照品（A）和咖啡因?qū)φ掌罚˙）的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of EGCG（A）and Caffeine（B）

2.2 靜態(tài)吸附、解吸性能的比較

考察了3種不同類(lèi)型的吸附樹(shù)脂對(duì)綠茶提取液中咖啡因和兒茶素EGCG的吸附、解吸性能，計(jì)算結(jié)果列于表1.

表1 靜態(tài)吸附、解吸結(jié)果Tab.1 Results of static adsorption and desorption

由表1可知:比表面積最大的XAD-200對(duì)咖啡因和EGCG的吸附量最大，隨著比表面積的增大，樹(shù)脂對(duì)咖啡因的吸附量也相應(yīng)增加，這也許是由于3種樹(shù)脂均為弱極性或非極性樹(shù)脂，主要以表面物理吸附為主，所以比表面積成為影響吸附量的關(guān)鍵因素.而對(duì)EGCG的吸附，S-8、XAD-200的吸附量均高于X-5，這可能是因?yàn)镋GCG分子中含有多個(gè)酚羥基，可與弱極性、中極性樹(shù)脂中的極性基團(tuán)之間產(chǎn)生附加的靜電親和力，因而對(duì)EGCG的吸附量有所增加.XAD-200對(duì)咖啡因的吸附平衡常數(shù)遠(yuǎn)大于兒茶素EGCG的，說(shuō)明該樹(shù)脂對(duì)咖啡因的吸附選擇性遠(yuǎn)大于兒茶素EGCG，利用XAD-200對(duì)兩者較大的吸附差異有可能將兩者有效層析分離.采用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇水溶液解吸，EGCG和咖啡因的靜態(tài)解吸率約為90%左右，解吸效果較好，利于樹(shù)脂再生.綜合考慮吸附選擇性和解吸效果，認(rèn)為XAD-200是一種較為理想的兒茶素脫咖啡因的分離介質(zhì).

2.3 動(dòng)態(tài)吸附泄露曲線(xiàn)

圖2 綠茶提取物在XAD-200上的動(dòng)態(tài)吸附曲線(xiàn)Fig.2 Dynamic adsorption curve on XAD-200 resin of green tea extract

靜態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，XAD-200樹(shù)脂適用于兒茶素和咖啡因的層析分離，故進(jìn)一步測(cè)定了該樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附泄露曲線(xiàn) (見(jiàn)圖2).由圖2可知，XAD-200對(duì)咖啡因的吸附選擇性較大，兒茶素EGCG在1.5 BV后就開(kāi)始泄漏，并很快達(dá)到吸附飽和，咖啡因在6 BV后才開(kāi)始泄漏，單獨(dú)收集1.5～6 BV間的流出液可得到低咖啡因含量的兒茶素.HPLC圖譜見(jiàn)圖3，圖3顯示，經(jīng)XAD-200樹(shù)脂柱層析分離，咖啡因的吸收峰 (保留時(shí)間18.389 min)已明顯縮小，兒茶素EGCG(保留時(shí)間19.815 min)在吸附過(guò)程中流出.

2.4 吸附層析分離結(jié)果

供試液中EGCG和咖啡因的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為48.65%、6.37%，XAD-200樹(shù)脂吸附流出液 (單獨(dú)收集1.5～6 BV間的流出液)中，咖啡因質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至0.27%，且 EGCG質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高至66.37%，說(shuō)明吸附過(guò)程中部分色素也被除去 (被樹(shù)脂吸附).

吸附完畢，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇水溶液淋洗，吸附在樹(shù)脂上的EGCG和咖啡因同時(shí)被淋洗下來(lái)，洗脫液回收，樹(shù)脂再生完畢可多次重復(fù)使用.考察了上柱液量對(duì)兒茶素EGCG吸附層析分離效果的影響，其結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 吸附層析分離效果Tab.2 Results of dynamic adsorption and separation%

由表2可知，上柱液量對(duì)EGCG的收率影響較大，上樣量6 BV時(shí)收率最高，即咖啡因剛開(kāi)始泄露即停止上樣為最佳.上樣量較少時(shí)，EGCG被吸附在樹(shù)脂上，故收率低;上樣量較大時(shí)，會(huì)出現(xiàn)咖啡因和EGCG同時(shí)泄露，后面收集的樣品只能回收，故EGCG的收率也會(huì)下降.上柱液量超過(guò)6 BV后，收集液中EGCG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差不大，咖啡因的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在0.30%以?xún)?nèi).

3 結(jié)論

1)具有高比表面積的弱極性吸附樹(shù)脂XAD-200對(duì)咖啡因和兒茶素EGCG吸附容量較大.

2)該樹(shù)脂對(duì)咖啡因的吸附平衡常數(shù)遠(yuǎn)大于兒茶素EGCG，顯示出對(duì)咖啡因具有較高的吸附選擇性，利用這一性能，可用于兒茶素脫咖啡因.

3)在動(dòng)態(tài)吸附過(guò)程中，兒茶素優(yōu)先泄漏，咖啡因被樹(shù)脂吸附，單獨(dú)收集此流出液可得兒茶素流分，EGCG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由48.65%提高至66.00%以上，咖啡因的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至0.30%以下，最佳上樣量 (6 BV)下，EGCG收率可達(dá)65.21%.

4)樹(shù)脂法脫咖啡因，工藝操作簡(jiǎn)單，能耗低，避免大量有毒有機(jī)溶劑的使用，利于提高兒茶素產(chǎn)品的整體品質(zhì).

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