從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體:一個(gè)受信號(hào)分子調(diào)控的蛋白質(zhì)分泌過(guò)程

王家勝，羅建紅，張?bào)忝?綜述

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，浙江杭州 310058)

蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸過(guò)程，也稱為早期分泌途徑(early secretary pathway)，是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制和分選的重要階段。蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)過(guò)初步加工后，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出 位 點(diǎn) (Endoplasmic Reticulum exit sites，ERES)與外被蛋白復(fù)合體Ⅱ(coat protein complexⅡ，COPⅡ)形成囊泡，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離。囊泡隨即脫掉COPⅡ并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間 體(ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC)融合。蛋白在ERGIC內(nèi)進(jìn)一步成熟，并形成管狀的囊泡［1］離開(kāi)ERGIC，由動(dòng)力蛋白沿微管運(yùn)往高爾基體。

受體接受細(xì)胞內(nèi)外的刺激后經(jīng)信號(hào)分子傳導(dǎo)引發(fā)細(xì)胞特定的響應(yīng)，而蛋白質(zhì)磷酸化在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸過(guò)程也是受信號(hào)分子磷酸化調(diào)控的。這種調(diào)控使得蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)速率可以因細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化而調(diào)整，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、維持穩(wěn)態(tài)有重要意義［2］。作者針對(duì)蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸過(guò)程(著重于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、ERGIC、高爾基體之間)的信號(hào)分子調(diào)控機(jī)制作一綜述。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上信號(hào)分子對(duì)蛋白質(zhì)分泌的調(diào)控

蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)經(jīng)過(guò)初步折疊、修飾后，在ERES形成COPⅡ囊泡。COPⅡ不僅能招募和聚集待運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)，還促進(jìn)了囊泡的出芽過(guò)程［3］。雖然有證據(jù)顯示，包含載脂蛋白的乳糜微粒囊泡出芽并不依賴于COPⅡ［4］，但絕大多數(shù)蛋白質(zhì)囊泡的出芽是依賴 COPⅡ的［5］。小GTP酶Sar1和兩種異源二聚體復(fù)合物Sec23-Sec24、Sec13-Sec31共同組成COPⅡ囊泡的外被。在COPⅡ囊泡形成時(shí)，首先由鳥(niǎo)苷酸交換因子Sec12招募Sar1-GDP，并將其轉(zhuǎn)化為Sar1-GTP，Sar1-GTP作為“開(kāi)關(guān)分子”引發(fā)外被形成過(guò)程。接著，Sec23-Sec24與可溶性蛋白受體或跨膜蛋白結(jié)合發(fā)揮貨物蛋白質(zhì)(cargo protein)揀選功能。最后，Sec13-Sec31在Sec23-Sec24外周形成一層易彎曲的“籠子”，以適應(yīng)不同大小的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)多條信號(hào)通路和多種信號(hào)分子能作用于ERES，從而調(diào)控蛋白質(zhì)運(yùn)輸囊泡的出芽過(guò)程。

1.1 MAPK信號(hào)通路 通過(guò)小干擾 RNA(siRNA)篩選Hela細(xì)胞的916種激酶和磷酸酶，確定了其中122種激酶和磷酸酶與囊泡從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基的運(yùn)輸有關(guān)［6］。其中包含了MAPK信號(hào)通路中的各種激酶，其作用位點(diǎn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng);激活MAPK信號(hào)通路能引起ERES數(shù)目增加，并且MAPK蛋白Erk2能直接磷酸化Sec16第415位蘇氨酸。Sec16是一種分子量為240-280 kDa的膜周邊蛋白，是ERES產(chǎn)生和維持的關(guān)鍵分子，生理狀態(tài)下定位在ERES。研究發(fā)現(xiàn)，Sec16能與COPⅡ組成蛋白(Sec13-Sec31，Sec23-Sec24)相互作用，并招募 COPⅡ組成蛋白在 ERES聚集促進(jìn)囊泡形成［7］。Sec16還以通過(guò)尚不明確的機(jī)制招募Sar1促進(jìn)囊泡形成［8］。因此，MAPK通路激活導(dǎo)致Sec16激活可以促進(jìn)COPⅡ形成。

1.2 PCTAIRE激酶與 Sec23A PCTAIRE是一種周期蛋白依賴激酶，主要存在于分化終末的細(xì)胞中。PCTAIRE亞型PCTAIRE-1能被周期蛋白Y(Cyclin Y)激活，并參與神經(jīng)元軸突囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)［9］。PCTAIRE也被發(fā)現(xiàn)在微管相關(guān)蛋白tau的磷酸化中起作用，但不依賴于周期蛋白激活［10］。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，磷酸化的PCTAIRE-1和3可以與磷酸化的Sec23A相互作用，并且PCTAIRE的激酶活性對(duì)COPⅡ的出芽是必需的［11］。雖然PCTAIRE并不直接磷酸化Sec23A和其他COPⅡ蛋白，但可能通過(guò)磷酸化與COPⅡ出芽相關(guān)的分子如動(dòng)力蛋白(Dynein)和動(dòng)力蛋白激活蛋白(Dynactin)發(fā)揮調(diào)控作用［12］。已經(jīng)有研究表明，PKA 對(duì)PCTAIRE-1的磷酸化能減弱PCTAIRE-1的激酶活性，影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤突起生長(zhǎng)［13］;而周期蛋白依賴激酶5(CDK5)對(duì)PCTAIRE-1的磷酸化則能增強(qiáng)其激酶活性，并促進(jìn)神經(jīng)元樹(shù)突發(fā)育［14］。但上述PCTAIRE激酶活性的調(diào)控對(duì)COPⅡ出芽的影響還有待進(jìn)一步研究證明。

1.3 Ca2+依賴的ALG-2調(diào)控 凋亡相關(guān)基因2蛋白(Apoptosis-linked gene 2 protein，ALG-2)有5個(gè)依次相連的EF-hand結(jié)構(gòu)域與鈣離子結(jié)合，是一種細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的感受器。研究表明，生理狀態(tài)下ALG-2存在于ERES附近，在鈣刺激下會(huì)引起ALG-2成簇狀分布，鈣的螯合劑則會(huì)導(dǎo)致 ALG-2與 ERES共定位消失［15］。近年研究發(fā)現(xiàn)，ALG-2與 COPⅡ組成蛋白Sec31A有鈣離子依賴的相互作用，并成簇狀共定位分布，無(wú)論是降低ALG-2的表達(dá)量還是降低胞鈣濃度，都會(huì)減少Sec31A在ERES的量，同時(shí)簇狀分布消失［16，17］。熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Sec31A同ALG-2結(jié)合位點(diǎn)的突變將降低Sec31A與ERES結(jié)合的高親和性，提示ALG-2與Sec31A的結(jié)合對(duì)Sec31A在ERES發(fā)揮作用有重要關(guān)系［18］。還有研究顯示，在體外鈣離子作用下ALG-2通過(guò)穩(wěn)定COPⅡ囊泡結(jié)構(gòu)抑制COPⅡ的相互融合［19］，但體內(nèi) ALG-2對(duì) COPⅡ囊泡的調(diào)控還知之甚少。雖然上述研究表明ALG-2能通過(guò)對(duì)不同胞內(nèi)鈣濃度的響應(yīng)來(lái)調(diào)控Sec31A的量和分布，但鈣信號(hào)介導(dǎo)的ALG-2對(duì)COPⅡ囊泡具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1.4 脂質(zhì)信號(hào)(lipid signaling) 類二十烷酸、磷酸肌醇、磷酸酰肌醇、鞘磷脂、脂肪酸等脂質(zhì)作為信號(hào)分子，在調(diào)控細(xì)胞增殖分化、凋亡、新陳代謝、遷移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［20］。細(xì)胞外信號(hào)能控制一系列脂質(zhì)酶的活性，這些酶通過(guò)對(duì)脂質(zhì)特異地修飾使脂質(zhì)發(fā)揮信號(hào)分子的作用。

磷酸酰肌醇(Phosphatidylinositol，PtdIns)的3個(gè)羥基被選擇性磷酸化得到的衍生物能作為不同膜性細(xì)胞器的標(biāo)志，在調(diào)控蛋白運(yùn)輸中起重要作用。PtdIns第4號(hào)位羥基被磷酸化得到的PtdIns(4)P主要存在于高爾基體及ERES上。PtdIns(4)P可由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上大量分布的PtdIns經(jīng)PI4K磷酸化產(chǎn)生［21］。研究發(fā)現(xiàn)，Sar1在ERES上被募集和激活能使PtdIns(4)P含量上升，而PtdIns(4)P能促進(jìn)COPⅡ囊泡的形成［22］。因?yàn)镻I4K亞型PI4KⅡ能在體外條件下被Sar1激活，且分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周?chē)?，因此Sar1可能通過(guò)PI4KⅡ調(diào)控PtdIns(4)P含量。此外，PI4K另一亞型PI4KⅢ在未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response，UPR)激活時(shí)含量增加，并促進(jìn)囊泡形成，也可能通過(guò)PtdIns(4)P途徑調(diào)控這個(gè)過(guò)程［23］。磷脂酰膽堿也有相似的調(diào)控過(guò)程。Sar1的磷酸化能激活磷酸酶D(Phospholipase D，PLD)，加快PLD將磷脂酰膽堿水解為膽堿和磷脂酸，后者進(jìn)一步促進(jìn)Sec23/Sec24 聚集，加快囊泡形成［24］。

2 ERGIC上信號(hào)分子調(diào)控

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間體(ERGIC)，也被稱為管泡樣囊泡聚集體(Vesiculo-tubular clusters)或前高爾基中間體(pre-Golgi intermediates)，是與ERES在空間上并列且位置相對(duì)固定的膜性結(jié)構(gòu)［25］，發(fā)揮聚集蛋白質(zhì)、促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊和質(zhì)量控制等作用。

人們對(duì)ERGIC上信號(hào)分子調(diào)控分泌途徑的機(jī)制知之甚少，目前僅發(fā)現(xiàn)包含PKC激酶家族的信號(hào)通路能對(duì)該過(guò)程進(jìn)行調(diào)控。根據(jù)PKC的激活方式可以將PKC家族分為經(jīng)典PKC 激 酶 (classical or conventional PKCs，cPKCs)、新型 PKC 激酶(novel PKCs，nPKCs)和非典型 PKC激酶(atypical PKCs，aPKCs)三類［26］。研究發(fā)現(xiàn)，Src激酶能磷酸化 aPKC激酶的 PKCλ 和 PKCι，促進(jìn) PKCλ 和 PKCι定位到ERGIC膜上，使PKCλ和PKCι發(fā)揮磷酸化甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的激酶活性［27］。有證據(jù)顯示，磷酸化的GAPDH在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的分泌途徑中可能通過(guò)招募動(dòng)力蛋白與微管結(jié)合并促進(jìn)囊泡從ERGIC出芽而發(fā)揮調(diào)控作用［28］。此外，新型PKC激酶PKCδ和PKCε也被發(fā)現(xiàn)作用于ERGIC并能調(diào)控ERGIC形態(tài)，但PKCδ和PKCε似乎并不影響蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體間的正向或逆向轉(zhuǎn)運(yùn)［29］。

3 高爾基體上信號(hào)分子調(diào)控

蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸不僅受胞外刺激引發(fā)的信號(hào)通路調(diào)控，還受到運(yùn)輸過(guò)程引發(fā)的反饋信號(hào)調(diào)節(jié)。近年來(lái)一系列研究發(fā)現(xiàn)，包含在囊泡內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白能間接激活高爾基體上信號(hào)通路產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，維持高爾基體的穩(wěn)態(tài)。

酪氨酸激酶Src被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于高爾基體周?chē)?，調(diào)控高爾基體的形態(tài)，并且磷酸化的Src對(duì)保持高爾基體結(jié)構(gòu)的完整是不可或缺的［30］。Src的缺失不會(huì)影響蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的順向轉(zhuǎn)運(yùn)速率，但會(huì)降低蛋白從高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)速率［31］。研究發(fā)現(xiàn)，貨物蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸促進(jìn)Src的激活，引發(fā)Src磷酸化高爾基體上一系列底物。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明Src與KDEL受體具有相互作用，這種相互作用還可直接介導(dǎo)Src的激活［32］。KDEL受體能特異地識(shí)別可溶性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白N端的KDEL氨基酸序列，位于ERGIC或高爾基體的KREL受體負(fù)責(zé)將可溶性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白逆向轉(zhuǎn)運(yùn)回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。當(dāng)可溶性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白運(yùn)達(dá)高爾基體，駐留蛋白與KDEL受體結(jié)合引發(fā)該受體的二聚化而激活，激活后的KDEL受體招募形成負(fù)責(zé)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的COPⅠ囊泡，將可溶性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白逆向轉(zhuǎn)運(yùn)回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Src能磷酸化KDEL受體，并且KDEL受體第209位絲氨酸磷酸化可以促進(jìn)其在高爾基體上與COPⅠ囊泡蛋白結(jié)合［33］，提示KDEL受體介導(dǎo)的Src激活能反饋?zhàn)饔糜贙DEL受體，促進(jìn)可溶性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。Src不僅影響貨物蛋白從高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，Src的激活還能促進(jìn)貨物蛋白在高爾基體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)［32］。因此，這種通過(guò)KDEL受體感知貨物運(yùn)輸“壓力”并通過(guò)激活Src促進(jìn)貨物蛋白在高爾基體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了高爾基體貨物輸入和輸出的平衡，有助于維持高爾基體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定［34］。

4 結(jié)論與展望

過(guò)去10年對(duì)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控機(jī)制的研究，極大增進(jìn)了人們對(duì)細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的了解。盡管現(xiàn)有的研究遠(yuǎn)不能讓人們了解囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)與調(diào)控機(jī)制的每個(gè)細(xì)節(jié)，但更多更細(xì)致的工作將最終會(huì)驅(qū)散籠罩于囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)控機(jī)制的迷霧。

信號(hào)分子調(diào)控作為調(diào)控機(jī)制的重要一種，在5年的研究中，發(fā)現(xiàn)其在囊泡從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)ERGIC到高爾基體的運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。雖然對(duì)信號(hào)分子調(diào)控機(jī)制的研究才剛剛起步，但一些令人信服的結(jié)果表明，信號(hào)分子能作用于運(yùn)輸涉及的三個(gè)膜性結(jié)構(gòu)——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、ERGIC和高爾基體，調(diào)控囊泡的出芽和融合。蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸不僅受胞外刺激引發(fā)的信號(hào)通路調(diào)控，還受到囊泡內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的反饋調(diào)節(jié)。如囊泡內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白能引起高爾基體上Src通路的激活，該過(guò)程對(duì)維持高爾基體的穩(wěn)態(tài)有重要意義。

由于各種信號(hào)通路間存在交叉(crosstalk)，極大增加了通路研究的復(fù)雜性。應(yīng)用系統(tǒng)生物學(xué)原理進(jìn)行高通量篩選是發(fā)現(xiàn)信號(hào)調(diào)節(jié)通路的趨勢(shì)。已有研究通過(guò)siRNA方法發(fā)現(xiàn)，從質(zhì)膜受體到靶細(xì)胞器調(diào)控膜轉(zhuǎn)運(yùn)的完整通路［6］，該MAPK通路作用于 ERES上的Sec16，通路的激活促進(jìn)囊泡出芽。以往的研究常常采用水泡性口炎病毒G蛋白(vesicular stomatitis virus G protein，VSV-G)來(lái)研究信號(hào)分子對(duì)囊泡運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控，但是生理情況下信號(hào)分子的調(diào)控應(yīng)該是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特異性的。如研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶PKA和PKC能磷酸化N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸(NMDA)受體的NR1亞基，促進(jìn)包含NR1亞基的 NMDA受體從 ERES排出［35］，這也正展示了一個(gè)特異性蛋白質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控的模式。對(duì)信號(hào)分子特異性調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的研究將極大發(fā)展人們對(duì)信號(hào)調(diào)控機(jī)制的理解，為治療因從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)異常引發(fā)的疾病如遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda，SEDT)、合并凝血因子V和凝血因子 VIII缺乏癥(combined factor V and factor VIII deficiency)等提供新的線索［36-38］。

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