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    三氧化二砷誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7凋亡對(duì)端粒酶活性的影響

    2012-01-25 16:47:06陳智嘉王景龍陳思嘉
    關(guān)鍵詞:端粒酶傳代端粒

    陳智嘉,谷 勵(lì),王景龍,陳思嘉

    (1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系,吉林長(zhǎng)春 130021;2.吉林省臨江市醫(yī)院,吉林 臨 江 134600;3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院11所,吉林 長(zhǎng)春 130122)

    乳腺癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一,近年發(fā)病率逐年上升,且發(fā)病年齡也趨于年輕化。近年來研究發(fā)現(xiàn)As2O3不僅對(duì)APL細(xì)胞,而且對(duì)其他血液腫瘤細(xì)胞[1-2]和許多實(shí)體瘤細(xì)胞均具有誘導(dǎo)凋亡作用[3-4]。Wang 等[5]研究表明端粒酶與惡性腫瘤發(fā)生有著緊密的關(guān)聯(lián),p21特異性核苷酸序列能夠抑制端粒酶的活性,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。也許端粒酶的活性指標(biāo)在治療惡性腫瘤的過程能提供新的策略。

    本實(shí)驗(yàn)對(duì)As2O3對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用及在不同濃度下端粒酶活性的變化進(jìn)行了研究。以期為治療乳腺癌的過程中提供新的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與細(xì)胞株 純?cè)噭〢s2O3購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,配成(1 mmol·L-1),溶于 PBS 液,凍存;RPMI 1640、胎牛血清(FBS)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰酶實(shí)驗(yàn)耗材等購(gòu)自Gibco公司;DMSO(生工生物);RT-PCR kit寶生物工程(大連)有限公司;其他試劑均由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。人乳腺癌細(xì)胞MCF-7株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所,本室自己傳代保存。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞采用開放式單層貼壁培養(yǎng),培養(yǎng)液為RPMI 1640(含10%小牛血清,青霉素100 kU·L-1,鏈霉素 1 00 mg·L-1),培養(yǎng)條件為 3 7℃,5%CO2,相對(duì)飽和濕度。每日觀察生長(zhǎng)情況,貼壁2~5 d傳代1次。傳代時(shí)用0.25%胰酶消化后,加入培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液,繼續(xù)傳代,并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.3 MTT法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞系,制成每升約含有1×108個(gè)單細(xì)胞懸液。分別接種于96孔板,每孔加細(xì)胞懸液100 μl,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中24 h后。將實(shí)驗(yàn)分6組即對(duì)照組和5給藥組,按分組情況分別加入(0.5,0.8,1.0,1.5 和2.0 μmol·L-1)的 A s2O3,每個(gè)濃度設(shè) 5 個(gè)復(fù)孔,每孔終體積200 μl,培養(yǎng)48 h后,每孔加入50 μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸棄培養(yǎng)液,每孔加入100 μl DMSO,充分振蕩10 min,于酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm處吸光度值。計(jì)算細(xì)胞成活率/%=(實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值)×100%。

    1.4 抑制端粒末端轉(zhuǎn)移酶的活性 依據(jù)PCR-ELISA方法平均值來測(cè)定端粒末端轉(zhuǎn)移酶的活性,首先培養(yǎng)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞系加入終濃度分別為(0.5、0.8、1.0、1.5和2.0 μmol·L-1)的 A s2O3,每個(gè)濃度設(shè) 5 個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng) 2 4 h后進(jìn)行裂解細(xì)胞通過PCR-ELISA方法測(cè)定其平均值。同時(shí)加入1.5 μmol·L-1的 A s2O3后分別培養(yǎng)24、48 和72 h 后測(cè)定其平均值。

    2 結(jié)果

    2.1 MTT比色法測(cè)定As2O3對(duì)細(xì)胞存活率的影響 通過MTT法測(cè)定發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組比,給藥組的細(xì)胞存活率隨著As2O3的濃度的增加明顯呈現(xiàn)劑量依賴性降低。其中給藥濃度為2.0 μmol·L-1,細(xì)胞的存活率為(41.69 ± 0 .25)%(P<0.01)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可以作為抑制癌細(xì)胞增殖的參考數(shù)據(jù)。

    2.2 端粒酶活性的變化 端粒酶是一種能延長(zhǎng)端粒末端的核糖核酸蛋白酶,通過延長(zhǎng)端粒DNA從而阻滯因端粒酶縮短而誘發(fā)的細(xì)胞衰老,使細(xì)胞具有無限增殖能力。因此,端粒酶與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。按照說明書進(jìn)行端粒酶活性檢測(cè),在酶標(biāo)儀中得到端粒酶的OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與對(duì)照組組相比,當(dāng) As2O3達(dá)到 1.5、2.0 μmol·L-1時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。當(dāng) As2O3濃度為1.5 mmol·L-1,時(shí)間達(dá)72 h時(shí)As2O3抑制端粒酶的活性經(jīng)PCR-ELISA方法檢測(cè)均具有時(shí)間-濃度的依賴性結(jié)果,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 討論

    As2O3作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥,在治療急性早幼粒細(xì)胞白血病過程取得了明顯的療效。近年來研究表明As2O3能夠誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞的凋亡,諸如急性早幼粒白細(xì)胞、骨髓癌細(xì)胞、神經(jīng)瘤細(xì)胞、食道癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、惡性腎腫瘤細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、喉癌細(xì)胞。對(duì)(1)通過MTT法測(cè)定As2O3對(duì)細(xì)胞存活率的影響;(2)通過PCR-ELISA方法測(cè)定端粒酶活性的變化;端粒酶是一種能延長(zhǎng)端粒末端的核糖核酸蛋白酶,能在多種腫瘤中高表達(dá),而在良性和正常組織中低表達(dá),是腫瘤預(yù)后和重要的抗腫瘤靶點(diǎn)[6]。據(jù)最近研究報(bào)道端粒酶在不同的細(xì)胞周期階段發(fā)揮著重要的作用,尤其在細(xì)胞G0/G1活性明顯增強(qiáng)[7]。通過用PCR-ELISA法測(cè)定經(jīng)As2O3處理過的乳腺癌細(xì)胞端粒酶活性的變化,我們發(fā)現(xiàn)隨著As2O3的濃度和反應(yīng)時(shí)間上的不斷增加,端粒酶的活性不斷降低。因此推斷As2O3能抑制乳腺癌細(xì)胞端粒酶活性在時(shí)間-濃度均呈依賴性,這為As2O3在治療乳腺癌的實(shí)踐中提供理論依據(jù)。

    [1]Zhou L,Hou J,F(xiàn)u W,et al.Arsenic trioxide and 2-methoxyestradiol reduce beta-catenin accumulation after proteasome inhibition and enhance the sensitivity of myeloma cells to Bortezomib[J].Leuk Res,2008,32(11):1674-83.

    [2]Sahara N,Takeshita A,Kobayashi M,et al.Phenylarsine oxide(PAO)more intensely induces apoptosis in acute promyelocytic leukemia and As2O3-resistant APL cell lines than As2O3by activating the mitochondrial pathway[J].Leuk Lymphoma,2004,45(5):987-95.

    [3]Yu J,Qian H,Wang Y,et al.Arsenic trioxide(As2O3)reduces the invasive and metastatic properties of cervical cancer cellsin vitroandin vivo[J].Gynecol Oncol,2007,106(2):400-6.

    [4]Wang X S,Wang G Y,Xu H T,et al.The effect of As2O3on induction of apoptosis and inhibition of telomerase activity in colon cancer LS-174T cells[J].Exper Toxiol Pathol,2007,29(6):415-8.

    [5]Wang X S,Wang K,Li X,et al.Effects of phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides on colorectal cancer cell growth and telomerase activity[J].World J Gastroenterol,2004,10(23):3455-8.

    [6]張少華,高尚風(fēng),郝志明,等.三氧化二砷誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3凋亡對(duì)端粒酶活性的影響[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,42(6):468-72.

    [6]Zhang S H,Gao S F,Hao Z M,et al.Effect of ovarian carcinoma cell line SKOV3 apoptosis induced by arsenic trioxide on telomerase activity)[J].Shanxi Med Univ,2011,42(6):468-72.

    [7]Chen G Q,Zhu J,Shi X G,et al.Invitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia:As2O3induces NB4 cell apoptosis with down regulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RAR alpha/PML proteins[J].Blood,1996,88(3):1052-61.

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