高效液相色譜法測(cè)定甲硝唑片中甲硝唑含量的不確定度評(píng)定

北京市門頭溝區(qū)藥品檢驗(yàn)所（102300）徐黎穎

甲硝唑片為《中國(guó)藥典》2010年版二部收載的品種[1]，適用于各種厭氧菌引起的感染及炎癥，亦可作為結(jié)腸、直腸等擇期手術(shù)前的預(yù)防用藥，還可用于治療腸道及腸外阿米巴?。ò⒚装透文撃[等）、陰道滴蟲病、小袋蟲病、麥地那龍線蟲病、賈第蟲病等[2]。甲硝唑片的含量測(cè)定方法為高效液相色譜法（HPLC）。測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)。本文根據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》、《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》、《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》等有關(guān)規(guī)定，分析HPLC法測(cè)定甲硝唑片中甲硝唑含量的影響因素，對(duì)其不確定度進(jìn)行評(píng)定，以期為HPLC法測(cè)定化學(xué)藥含量的不確定度評(píng)定提供參考。

1 測(cè)定方法與數(shù)據(jù)記錄

1.1 儀器與試劑 Agilent 1200S高效液相色譜儀（Agilent公司），AE-100電子天平（METTLER公司），XP-205DR電子天平（METTLER公司），甲硝唑?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100191-200305），甲硝唑片（批號(hào)：121051）。

附表1 對(duì)照品溶液實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

附表2 供試品溶液實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

附圖 不確定度的來(lái)源分析圖

1.2 液相色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水（20∶80）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm。理論塔板數(shù)按甲硝唑峰計(jì)算不低于2000。

1.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定甲硝唑?qū)φ掌芳s12.5mg，置50mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備 取甲硝唑片20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于甲硝唑0.25g），置50mL量瓶中，加50%甲醇適量，振搖使甲硝唑溶解，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5mL，置100mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.5 色譜分析方法與數(shù)據(jù)的記錄 分別精密吸取甲硝唑?qū)φ掌啡芤号c供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按外標(biāo)法以色譜峰面積計(jì)算，即為供試品中甲硝唑（C6H9N3O3）的含量。

1.6 數(shù)據(jù)記錄 20片片重5.7620g，平均片重0.2881g，數(shù)據(jù)見附表1和附表2。

2 不確定度評(píng)定

2.2 不確定度的來(lái)源分析 分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不確定度來(lái)源見附圖。

2.3 不確定度的量化分析

2.3.1 供試品溶液濃度引入的不確定度urel(Cs)

2.3.1.1 對(duì)照品溶液濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Cr)

2.3.1.1.1 對(duì)照品的純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Pr)對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，未提供不確定度值，本實(shí)驗(yàn)參考基準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度值，假定對(duì)照品含量為100.00%±0.05%，視為矩形分布則對(duì)照品純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3.1.1.2 對(duì)照品稱樣量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Wr)稱量使用電子天平XP-205DR，實(shí)際分度值d＝0.01mg，檢定證書給出載荷點(diǎn)誤差為0.03mg，重復(fù)性誤差為0.02mg，則單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

采用減重法稱量，上述分量應(yīng)計(jì)算2次，故對(duì)照品稱樣量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.1.1.3 對(duì)照品的稀釋引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vr)玻璃量具允差：對(duì)照品溶液稀釋過(guò)程中用到容量瓶（50±0.05）mL（A級(jí)），按矩形分布處理標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

環(huán)境溫度：實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度在空調(diào)條件下，設(shè)置室溫為（20±5）℃。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，按照矩形分布處理標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.1.1.4 對(duì)照品溶液濃度引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Cr)

2.3.1.2 對(duì)照品溶液峰面積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel( Ar)實(shí)驗(yàn)中取對(duì)照品溶液r1、r2，分別進(jìn)樣5次、2次，取峰面積平均值計(jì)算。

對(duì)照品溶液r1引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：=0.000105；對(duì)照品溶液r2引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，采用極差法計(jì)算，n＝2，C=1.13：=0.000120；對(duì)照品溶液峰面積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 ：=0.000159。

2.3.1.3 供試品溶液峰面積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(As)實(shí)驗(yàn)中供試品溶液t1、t2，分別進(jìn)樣2次、2次，取峰面積平均值計(jì)算。采用極差法分別計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，

2.3.1.4 供試品溶液濃度引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Cs)

采用減重法稱量，上述分量應(yīng)計(jì)算2次，故供試品稱樣引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.3 供試品的稀釋引入的不確定度urel(Vs)

供試品的稀釋過(guò)程中分別用到容量瓶（50±0.05）mL（A級(jí)）、（100±0.10）mL（A級(jí)）、單標(biāo)線吸管（5±0.015）mL（A級(jí)），參照對(duì)照品的稀釋引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算方法。

2.3.3.1 容量瓶（50±0.05）mL（A級(jí)）引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3.3.2 容量瓶（100±0.10）mL（A級(jí)）引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3.3.3 單標(biāo)線吸管（5±0.015）mL（A級(jí)）引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3.4 平均片重引入的不確定度urel(W)

稱量使用電子天平AE-100，檢定分度值d＝0.1mg，檢定證書中給出載荷點(diǎn)誤差為-0.1mg，重復(fù)性誤差為0.1mg，則單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：采用減重法稱量，上述分量應(yīng)計(jì)算2次，故平均片重引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

供試品溶液濃度、供試品稱樣量、供試品的稀釋、平均片重等影響因素相互獨(dú)立，則合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)：實(shí)驗(yàn)測(cè)得X＝95.6%，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(X)：u(X)=urel( X)×X=0.00638×95.6%=0.61%。

2.5 擴(kuò)展不確定度

取包含因子k＝2，則含量測(cè)定結(jié)果的擴(kuò)展不確定度U（X）：U(X)= k ×u(X)=2×0.61%=1.22%。

3 結(jié)果報(bào)告

高相液相色譜法測(cè)定甲硝唑片中甲硝唑的含量為：X＝（95.6±1.2）% ；k＝2。