SORL1基因rs2070045單核苷酸多態(tài)性與遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙的關(guān)聯(lián)分析

高 欣 于會艷 孫 亮 曾湘豫 劉 銘 楊 澤 高芳堃 秦 斌

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是以進行性認(rèn)知功能障礙和記憶損害為特征的神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病。AD病因復(fù)雜，涉及到遺傳、環(huán)境、代謝、病毒感染等多種因素。1991年，Goate A等發(fā)現(xiàn)早發(fā)家族性AD患者的21號染色體上淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）基因17號外顯子發(fā)生了突變［1］，由此人們對AD的研究進入了分子遺傳學(xué)這一嶄新的領(lǐng)域，對AD患者相關(guān)致病基因的篩查已成為近20年來研究的熱點。輕度認(rèn)知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）是介于正常老齡和癡呆的過渡階段，相當(dāng)一部分MCI患者會進展為AD。尤其是遺忘型 MCI（amnestic mild cognitive impairment，aMCI），其以記憶損害為主要表現(xiàn)，Mayo老年癡呆研究中隨訪一組患者，證明在第6年時大約80%的aMCI患者已轉(zhuǎn)化為AD［2］，而相應(yīng)年齡的正常人群每年AD的發(fā)病率僅約1%～2%［3］，因此越來越多的學(xué)者注重于aMCI的研究，尤其是aMCI向AD轉(zhuǎn)化的相關(guān)因素和生物學(xué)標(biāo)記。2007年Rogaeva等首次提出分 揀 蛋 白 相 關(guān) 受 體 1（sortilin-related receptor1，SORL1，又稱SORLA或LR11）基因可能是AD患病的第二風(fēng)險因子，研究發(fā)現(xiàn)遺傳性或獲得性的SORL1受體表達或功能改變［4］，可能涉及AD發(fā)生的機制。目前對SORL1基因研究比較多的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是SNP19（rs2070045），Meta分析表明rs2070045攜帶G等位基因的人群患AD的風(fēng)險大于攜帶T等位基因的人群［5］，但是SORL1基因rs2070045單核苷酸多態(tài)性在中國漢族aMCI人群中鮮有報道，本研究通過對aMCI患者SORL1基因rs2070045進行多態(tài)性檢測，探討該位點多態(tài)性與aMCI的相關(guān)性和風(fēng)險。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究樣本人群來自國家自然科學(xué)基金“社區(qū)老年人輕度認(rèn)知障礙綜合篩查模式的研究”課題。于2011年1月～2011年6月在北京某社區(qū)經(jīng)篩查得到aMCI患者139例，男41例，女98例，平均年齡（74.5±5.7）歲，作為aMCI組；體檢正常者213例作為對照組，男82例，女131例，平均年齡（69.4±7.1）歲。對照組與aMCI組性別、文化程度、生活背景等相互匹配，并確定為無血緣關(guān)系的健康者。

1.2 方法

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) aMCI診斷標(biāo)準(zhǔn)參見文獻［6］并略作修改：（1）記憶障礙是基本和主要的主訴；（2）有記憶減退的客觀檢查證據(jù)，記憶障礙的客觀檢查低于同年齡及教育程度1.5個標(biāo)準(zhǔn)差以上；（3）一般認(rèn)知功能正常，精神狀態(tài)簡易速查表（mini-mental state examination，MMSE）總分≥24分；（4）日常生活能力保留，日常生活能力量表（activities of daily living scale，ADL）＜26分（21項）；（5）無癡呆，臨床癡呆評定量表（Clinical Dementia Rating，CDR）為0.5分，沒有足夠的認(rèn)知障礙診斷為癡呆，不符合美國神經(jīng)病學(xué)、語言障礙和卒中－老年性癡呆和相關(guān)疾病學(xué)會（NINCDS-ADRDA）的有關(guān)癡呆的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（6）排除其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病和其他軀體疾病導(dǎo)致的記憶力下降；（7）經(jīng)漢密爾頓抑郁量表（hamilton depression scale，HAMD）篩查排除抑郁狀態(tài)；（8）Hachinski缺血評分：以≤4分排除血管性認(rèn)知障礙。每個病例根據(jù)病史體檢量表測試成績，結(jié)合CT或MRI進行反復(fù)討論分析，最后作出診斷。對照組為同期入組相匹配的正常對照者，均符合（1）無記憶力減退主訴，無嚴(yán)重軀體疾病，檢查合作；（2）MMSE總分≥26分；（3）CDR＝0。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除AD、血管性癡呆﹑帕金森氏性癡呆及腦器質(zhì)性疾病所致的各種癡呆患者。排除正處于心血管、肺、肝、腎等重大軀體疾病急性期的患者，排除頭部外傷史、特殊藥物服用史等。兩組間年齡性別差異不明顯（P＞0.05）。

采用的神經(jīng)心理學(xué)量表：精神狀態(tài)簡易速查表（mini-mental state examination，MMSE）、臨床記憶量表（clinical memory scale，CMS）、臨床癡呆量表（Clinical Dementia Rating，CDR）、日常生活行為量表（activities of daily living scale，ADL）、Hachinski缺血積分表（hachinski ischaemic scale，HIS）及漢密爾頓抑郁量表（hamilton depression scale，HAMD）。

1.2.2 靜脈血采集 在受檢者知情同意情況下，清晨取空腹靜脈血5 ml，血樣加EDTA抗凝劑后保存于－80℃冰箱中，用于DNA提取。

1.2.3 基因組DNA提取及定量取EDTA抗凝的受試者靜脈血0.5 ml，用全基因組DNA提取試劑盒抽提DNA，通過蛋白／核酸比色儀對提取的基因組DNA進行濃度和純度的分析，根據(jù)測定結(jié)果將樣本DNA稀釋至20μg／μl的工作液置于4℃冰箱。

1.2.4 位點選擇 SORL1基因rs2070045（G／T）SNP多態(tài)性位點。引物序列分別為上游引物：5’-AACGACTGGA CGGACTGGT-3’，下游引物5’-CGGATGAGTGCTGTCAACTGAG-3’，擴增產(chǎn)物長度為78 bp。

1.2.5 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系10μl，其中包含DNA模板1μl，10×PCR Buffer 1μl，10mmol／L dNTP0.2μl，Taq DNA 聚合酶（5 U／μl）0.2μl，rs2070045上下游引物（10 pmol／μl）各0.2μl，1×LC-green PLUS飽和熒光染料1μl，寡核苷酸內(nèi)參0.2μl（高溫寡核苷酸內(nèi)參與低溫寡核苷酸內(nèi)參4個片段各0.05μl），去離子水補充總體積至10μl。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min后進入主循環(huán)，95℃ 變性30 s，55℃ 退火30 s，72℃延伸6 s，總共45個循環(huán)，完成后72℃延伸7 min，之后進行HRM分析之前的變性和復(fù)性處理，程序為95℃30 s，25℃2 min，94℃30 s，24℃4 min。

表1 HRM－PCR的引物序列、退火溫度及其產(chǎn)物長度

1.2.6 HRM檢測 將PCR產(chǎn)物移入HRM專用96孔板內(nèi)，在 Lightscanner TMHR-I 96上進行HRM分析：從45℃開始，以0.3℃／s的斜率采集熔解曲線，到98℃結(jié)束，用Light-Scanner Call IT軟件對采集后的曲線進行分析，判定基因型。

1.2.7 測序驗證 根據(jù)HRM分析的不同曲線確定不同的基因型。從所得的不同基因型的個體中分別隨機抽取5例樣本進行測序驗證。測序樣本重新進 行 PCR 擴 增，上 游 引 物 為 5＇-CCGGAGTGACGAGTACAA-3＇，下 游 引 物 為 5＇-CTCGCTGATTTCTAAGGTCC-3＇，擴增片段長度為229bp。PCR反應(yīng)體系30μl，包含 DNA 模板3μl，10×PCRBuffer 5μl，10mmol／L dNTP1μl，Taq DNA聚合酶（5 U／μl）1μl，上下游引物（10 pmol／μl）各0.6μl，去離子水補充總體積至30μl。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min后進入主循環(huán)，95℃變性30 s，58.5℃退火30 s，72℃延伸45 s，總共35個循環(huán)，完成后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察合格后送華大基因測序部進行測序驗證。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理 運用Hardy-Weinberg平衡檢驗研究樣本的群體代表性。用比數(shù)比（OR）值及其95%置信區(qū)間（95%CI）來評價相對風(fēng)險。實驗數(shù)據(jù)中計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗，組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，采用SPSS 11.5軟件。

2 結(jié) 果

2.1 SORL1基因rs2070045單核苷酸多態(tài)性的基因型分析 SORL1基因rs2070045單核苷酸多態(tài)性位點分為3種基因型：GG，GT，TT。通過HRM分型系統(tǒng)分析，可根據(jù)樣本的熔解曲線差異，將所有樣本分為3組基因型。3組之間的熔解曲線差異非常顯著（圖1）。每組中隨機挑選5例樣本進行測序驗證，進行基因型的確定以及HRM分型結(jié)果準(zhǔn)確性的評估。HRM分型的結(jié)果與測序的結(jié)果完全吻合，準(zhǔn)確率為100%，測序圖見圖2。

2.2 SORL1基因rs2070045單核苷酸多態(tài)性的基因型與等位基因頻率在aMCI患者和正常對照者中的分布 以Hardy-Weinberg平衡法檢驗aMCI組和正常對照組的基因型頻率，等位基因的分布具有群體代表性（P＞0.05）。

SORL1 rs2070045單核苷酸多態(tài)性基因型及等位基因頻率分布見表2，三種基因型頻率在aMCI組和對照組間的分布有顯著差異（χ2＝7.109，P＝0.029），兩種等位基因頻率在兩組間的分布也有顯著差異（χ2＝7.315，P＝0.007）。G等位基因為危險等位基因（OR＝1.528，95%CI為1.123～2.080），不同遺傳模型下GG＋GT基因型與對照組有顯著差異（OR＝1.873，95%CI為1.061～3.308），為危險基因型，GG純合基因型與對照組也有顯著差異（OR＝1.658，95%CI為1.053～2.612），為危險基因型（表3）。

圖1 SORL1基因rs2070045單核苷酸多態(tài)性HRM分型的熔解曲線 紅色代表TT基因型，藍色代表GG基因型，灰色代表GT基因型

圖2 SORL1基因rs668387單核苷酸多態(tài)性樣本抽樣測序圖 （A圖為GG型，B圖為TT型，C圖為GT型）

表2 SORL1基因rs2070045基因型和等位基因頻率在aMCI組和對照組的分布［n（%）］

2.3 不同性別aMCI組與對照組SORL1 rs2070045基因型及等位基因頻率比較 男性aMCI組與對照組SORL1基因型及等位基因頻率分布無顯著差異（表4），SORL1基因rs2070045不同遺傳模型下基因型在男性aMCI組和正常對照組的分布無顯著差異（表5），女性aMCI組與對照組基因型無顯著差異但是等位基因頻率分布有顯著差異（表6），SORL1基因rs2070045不同遺傳模型下基因型在女性aMCI組和正常對照組的分布無顯著差異（表7）。

表3 SORL1基因rs2070045不同遺傳模型下基因型在aMCI組和對照組的分布［n（%）］

表4 SORL1基因rs2070045基因型和等位基因頻率在男性aMCI組和對照組的分布［n（%）］

表5 SORL1基因rs2070045不同遺傳模型下基因型在男性aMCI組和對照組的分布［n（%）］

3 討 論

認(rèn)知障礙的病因及致病機制目前仍不十分清楚，研究表明，除少數(shù)家族性AD外，絕大多數(shù)AD都呈散發(fā)性。散發(fā)AD由多因素及多基因?qū)е拢壳爸T多等位基因中得到廣泛證實是晚發(fā)型AD的風(fēng)險因子的有APOEε4［7］。2007年Rogaeva等首次提出SORL1可能是AD患病的第二風(fēng)險因子［4］，但是對aMCI的遺傳學(xué)研究仍然很局限，尤其是aMCI向AD轉(zhuǎn)化的相關(guān)因素和生物學(xué)標(biāo)記。由于缺乏aMCI有效的臨床診斷方法，以及其發(fā)展的難以預(yù)測性，因此，以遺傳學(xué)作為篩選aMCI易感人群的生物學(xué)標(biāo)記物成為熱點。如果能夠發(fā)現(xiàn)與aMCI有關(guān)的致病基因，就有可能提高對aMCI的診斷，并作為預(yù)測aMCI病情發(fā)展的標(biāo)記。從aMCI層面闡明和證實AD的易感基因，可以為AD患者的有效篩查、早期診斷、臨床治療和干預(yù)提供線索，具有重要的社會、經(jīng)濟和科學(xué)意義。

表6 SORL1基因rs2070045基因型和等位基因頻率在女性aMCI組和對照組的分布［n（%）］

表7 SORL1基因rs2070045不同遺傳模型下基因型在女性aMCI組和對照組的分布［n（%）］

SORL1基因位于人類11號染色體的長臂q 23.2-24.2區(qū)域，在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)表達，該基因編碼的受體穿梭于質(zhì)膜、內(nèi)涵體和高爾基體，在神經(jīng)元細(xì)胞中發(fā)揮轉(zhuǎn)運作用。SORL1受體可以阻止APP形成Aβ，SORL1受體減少將導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ水平增高，從而導(dǎo)致AD的發(fā)生。自2007年Rogaeva等首先報道了對6個不同種群的SORL1基因序列中的單核苷酸多態(tài)性研究，關(guān)聯(lián)分析表明SORL1基因的SNP與散發(fā)AD相關(guān)聯(lián)，但也表現(xiàn)出不同種群的差異性［4］。在此之后，陸續(xù)有研究證實SORL1基因多態(tài)性與AD相關(guān)［8，9］，但也有部分研究顯示無明顯關(guān)聯(lián)［10，11］。與AD相關(guān)的SNPs位于SORL1基因的兩個區(qū)域，靠近SORL1基因5’端的SNPs 8-10和3’端的SNPs 19-25。我們選取了SORL1基因5’端 的 SNP 8（rs668387）和 3’端 的 SNP19（rs2070045）、SNP23 （rs3824968）和 SNP24（rs2282649）4個位點進行了研究，除了rs2070045位點的基因型和等位基因頻率在aMCI人群和正常對照人群中有顯著差異外，其余3個位點未見差異（結(jié)果未顯示）。

SORL1基因rs2070045位點野生型基因型為TT，存在GG和GT兩種變異基因型。SORL1基因多態(tài)性與aMCI的關(guān)聯(lián)尚未見報道，本研究發(fā)現(xiàn)，aMCI人群GG，GT，TT三種基因型與正常對照人群三種基因型分布頻率有顯著性差異（P＜0.05），G等位基因頻率在aMCI和正常對照有顯著性差異（P＜0.01），為危險等位基因（OR＝1.528，95%CI為1.123～2.080），該位點G等位基因在女性中也是危險等位基因（OR＝1.501，95%CI為1.028～2.191）。本研究結(jié)果提示北京漢族人群SORL1基因rs2070045位點的G／T SNP多態(tài)性與aMCI關(guān)聯(lián)，G等位基因是危險等位基因，并且該等位基因在女性人群也是危險等位基因。該位點在西方人群中研究發(fā)現(xiàn)，攜帶G等位基因的人群患AD的風(fēng)險大于攜帶T等位基因的人群［5］；亞洲人群中日本人Kimura在晚發(fā)型AD人群研究中發(fā)現(xiàn)rs2070045位點G等位基因為風(fēng)險等位基因［12］，上海晚發(fā)型AD人群中發(fā)現(xiàn)rs2070045位點的G等位基因為風(fēng)險等位基因［13］，與本研究在aMCI人群中的發(fā)現(xiàn)一致，也就是說aMCI與AD具有相同的遺傳背景，由于aMCI是AD的高危人群，說明從aMCI階段預(yù)測其進展是可行的，可能對aMCI診斷和預(yù)測有幫助。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示SORL1基因rs2070045位點G／T SNP多態(tài)性與aMCI相關(guān)聯(lián)，并且在女性中得到了同樣的結(jié)果，說明SORL1基因rs2070045位點單核苷酸多態(tài)性與aMCI相關(guān)，該位點G等位基因可能是aMCI的危險因素之一。但是在男性中沒有看到相同結(jié)果，考慮可能與病例樣本量少，分性別后導(dǎo)致樣本量更少，或者是該危險因素與性別相關(guān)。由于aMCI人群具有向AD極高的轉(zhuǎn)化率，因此從aMCI階段尋找與患病相關(guān)的遺傳因素，具有非常重要的意義。但是SORL1基因存在多個位點的SNP，并且有人群特異性，要明確該基因與aMCI的關(guān)系，還應(yīng)選擇更多位點進行更大規(guī)模人群的研究。

1 Goate A，Chartie2 Harlin M C，Mullan M，et al.Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer＇s disease.Nature，1991，349（6311）：704-706.

2 Petersen RC，Parisi JE，Dickson DW，et al.Neuropathologic features of amnestic mild cognitive impairment.Arch Neurol，2006，63（5）：665-672.

3 Petersen RC.Mild cognitive impairment：transition between ageing Alzheimer＇s disease.Neurologia，2000，15（3）：93-101.

4 Rogaeva E，Meng Y，Lee JH，et al.The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer＇s disease.Nat Genet，2007，39（2）：168-177.

5 Reitz C，Cheng R，Rogaeva E，et al.Meta-analysis of the Association Between Variants in SORL1 and Alzheimer Disease.Arch Neurol，2011，68（1）：99-106.

6 Winblad B，Palmer K，Kivipelto M，et al.Mild cognitive impair-ment-beyond controversies，towards a consensus：report of the International Working Group on Mild Cognitive Impairment.J Intern Med，2004，256（3）：240-246.

7 Gatz M，Reynolds CA，F(xiàn)ratiglioni L，et al.Role of genes and environments for explaining Alzheimer disease.Arch Gen Psychiatry，2006，63（2）：168-174.

8 K?lsch H，Jessen F，Wiltfang J，et al.Association of SORL1 gene variants with Alzheimer＇s disease.Brain Res，2009，1264：1-6.

9 Feulner TM，Laws SM，F(xiàn)riedrich P，et al.Examination of the current top candidate genes for AD in a genome-wide association study.Mol Psychiatry，2010，15（7）：756-766.

10 Li H，Wetten S，Li L，et al.Candidate single-nucleotide polymorphisms from a genomewide association study of Alzheimer disease.Arch Neurol，2008，65（1）：45-53.

11 Liu F，Ikram MA，Janssens AC，et al.A study of the SORL1 gene in Alzheimer＇s disease and cognitive function.J Alzheimers Dis，2009，18（1）：51-64.

12 Kimura R，Yamamoto M，Morihara T，et al.SORL1is genetically associated with Alzheimer disease in a Japanese population.Neurosci Lett，2009，461（2）：177-180.

13 Ning M，Yang Y，Zhang Z，et al.Amyloid-beta-Related Genes SORL1 and ACE are Genetically Associated With Risk for Lateonset Alzheimer Disease in the Chinese Population.Alzheimer Dis Assoc Disord，2010，24（4）：390-396.