肝硬化患者胃動素受體表達(dá)與胃排空的研究

潘麗麗，殷積彬，高善玲，張文華，黃 淇，李 直，劉 超，胡麗紅，劉冰熔

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)1.附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科;2.形態(tài)學(xué)中心;3.附屬第二醫(yī)院放射線科;4.附屬第二醫(yī)院研究生科，黑龍江 哈爾濱 150086

腹脹是肝硬化患者主要腹部不適癥狀之一，直接影響患者的生活質(zhì)量，是臨床頑癥之一。肝硬化性腹脹一直被認(rèn)為是肝功能不全和門靜脈高壓所致，但由于其具體發(fā)生機(jī)制并不清楚，因此導(dǎo)致臨床治療效果不佳。胃動素受體(motilin receptor，MTL-R)表達(dá)異常是否參與了肝硬化患者胃排空功能紊亂，目前國內(nèi)外未見相關(guān)報道。本文主要研究肝硬化時胃動素受體在胃竇黏膜的表達(dá)及胃排空情況，進(jìn)一步深入了解肝硬化時胃排空功能紊亂的形成原因，尋找能夠改善肝硬化患者生活質(zhì)量的治療措施。

1 資料與方法

1.1 病例選擇及分組 選取2010年8月－2011年12月我院肝硬化住院患者32例，肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會、肝病學(xué)分會聯(lián)合修訂的病毒肝炎防治方案，均有早飽、上腹脹等癥狀，男20 例，女12 例，平均年齡(53.56 ±8.66)歲，乙型肝炎型肝硬化22例，丙型肝炎型肝硬化3例，自身免疫型肝炎肝硬化3例，戊型肝炎型肝硬化2例，不明原因型肝硬化2例。排除其他影響胃排空的疾病:消化性潰瘍、胃癌、幽門梗阻、心臟病、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、甲狀腺疾病以及嚴(yán)重全身性疾病;有腹部手術(shù)史，食管胃底靜脈曲張治療史者。根據(jù)胃黏膜病變分為有PHG組(17例)和無PHG組(15例)。根據(jù)第7版《內(nèi)科學(xué)》肝硬化Child-Pugh分級標(biāo)準(zhǔn)將患者分為3組:Child A組11例，Child B組11例，Child C組10例。選取18例健康對照者，男10例，女8例，平均年齡(48.77±14.39)歲。所有受試者受檢前7 d停用影響胃腸運(yùn)動的藥物，12 h前禁煙，簽訂知情同意書。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑:兔抗人 MTL-R抗體購自 Abgent公司。非生物素化山羊抗兔IgG抗體和DAB酶底物顯色試劑盒購自中杉金橋公司。一次性活檢鉗購自南京微創(chuàng)醫(yī)學(xué)科技有限公司，型號為MTN-BF-23。電子胃鏡為Olympus-GIF-Q240。

1.2.2 取材:受試者均空腹12 h行電子胃鏡檢查。在電子胃鏡下觀察胃黏膜的病變及有無PHG改變。按Maccormack分類標(biāo)準(zhǔn)將PHG分為輕型和重型。輕型為細(xì)微粉紅色樣斑點(diǎn)或猩紅熱樣疹，黏膜皺襞表淺，紅斑呈剝脫樣或鑲嵌圖案樣外觀。重型為彌漫性櫻桃紅樣斑點(diǎn)或彌漫融合性出血性胃炎。用一次性活檢鉗盡可能大地鉗取2塊胃竇部黏膜，立即放入10%甲醛液中固定。

1.2.3 操作流程:DAB顯色，PBS代替第一抗體作為陰性對照，蘇木精-伊紅染色和免疫組化操作步驟參照說明書，一抗滴度1∶10。

1.2.4 免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn):顯微鏡觀察，MTL-R陽性染色主要定位于腺體上皮細(xì)胞漿，胞漿有黃色或棕黃顆粒即為陽性細(xì)胞。在高倍視野下每張切片隨機(jī)選擇10個視野，以腺體為單位，用Image-Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析得出MTL-R表達(dá)的陽性值。

1.3 胃標(biāo)記物排空時間測定

1.3.1 不透X線標(biāo)記物及標(biāo)準(zhǔn)試餐:本研究采用自制膠囊型不透X線標(biāo)記物，其成分由兩部分構(gòu)成，外殼為雙歧三聯(lián)活菌腸溶膠囊的膠囊外殼(晉城海斯制藥有限公司)，內(nèi)容物為常規(guī)硫酸鋇干混懸劑(X線雙重造影用，購自青島東風(fēng)化工有限公司)。每個標(biāo)記物重量約為220 mg，安全無毒性，在胃內(nèi)不裂解、不吸收，進(jìn)入腸道內(nèi)完全崩解。因重量較輕，可與半固體食物混在一起，易于在食糜被攜帶推進(jìn)，順利通過幽門，要求受試者在進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)餐時吞服2枚。胃完全排空標(biāo)記物的時間反映胃排空情況。標(biāo)準(zhǔn)餐:雞蛋羹100 g+香腸75 g，為避免食物及標(biāo)記物在食管的滯留，飲純凈水200 mL。本試餐為固體與半固體之間的試餐，所有食物的溫度均為37℃(排除試餐溫度[1]對胃排空的影響)。

1.3.2 胃標(biāo)記物完全排空時間測定:所有受試者均空腹立位于數(shù)字成像X線機(jī)腹部攝片下，先口服常規(guī)上消化道造影用硫酸鋇劑20 mL，觀察食管及胃的輪廓。待硫酸鋇完全胃排空后，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)餐，進(jìn)餐同時服用2枚不透X線標(biāo)記物。所有受試者5 min內(nèi)進(jìn)食完畢。餐后立即面對探頭站立，全腹部曝光一次，記錄標(biāo)記物在胃中的位置。后患者保持安靜仰臥位態(tài)[2]。每0.5 h起立攝腹部平片一次，連續(xù)觀察直至標(biāo)記物完全排出胃進(jìn)入十二指腸。胃標(biāo)記物完全排空時間是指從受試者吞服2枚標(biāo)記物起的時間點(diǎn)至2枚標(biāo)記物完全排出胃的時間點(diǎn)，以標(biāo)記物完全排出幽門為準(zhǔn)。記錄各個受試者胃標(biāo)記物完全排空時間。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以表示，計量資料采用方差分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)及U檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用pearson相關(guān)檢驗(yàn)，分析胃動素受體表達(dá)與胃排空之間是否存在相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝硬化患者胃黏膜形態(tài)學(xué)變化

2.1.1 PHG 病變:鏡下53.1%(17/32)肝硬化患者呈現(xiàn) PHG，PHG 輕型占 9.4%(3/32)，PHG 重型占43.8%(14/32)，其中PHG重型肝硬化A級占6.3%(2/32)，B 級占 12.5%(4/32)，C 級占 25.0%(8/32)。

2.1.2 HE染色:HE染色標(biāo)本顯示肝硬化組胃竇黏膜水腫明顯，腺體上皮細(xì)胞變性壞死，黏膜層炎癥細(xì)胞浸潤。

2.2 MTL-R的表達(dá)情況 免疫組化示在人胃竇黏膜腺體上皮細(xì)胞中可檢測出MTL-R的表達(dá)，呈棕黃色顆粒(見圖1、2)。

肝硬化組MTL-R表達(dá)陽性值(22.9±13.0)%明顯低于正常組(44.8±9.2)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。有PHG組 MTL-R表達(dá)陽性值(17.3±10.3)%較無 PHG 組(29.3±13.0)%低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表1)。肝硬化Child-Pugh分級越高，MTL-R表達(dá)陽性值越低，Child A組為(35.4±7.8)%，Child B 組為(23.3 ± 7.9)%，Child C 組為(8.8±5.2)%，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表 2)。

2.3 胃標(biāo)記物排空情況 胃標(biāo)記物完全排空時間肝硬化組(223.28±90.31)min明顯延遲于正常組(166.77 ±62.54)min，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。有 PHG 組(272.35±63.16)min較無 PHG 組(167.67±85.21)min標(biāo)記物排空時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表1)。Child-Pugh分級越高，標(biāo)記物排空時間延長越明顯，Child B組(230.45±85.42)min和Child C 組(261.80 ±86.64)min均較正常組排空時間延長明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表2)。Child A 組(181.09 ±87.92)min 較正常組標(biāo)記物排空時間延長不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05，見圖3、4)。

表1 正常組和肝硬化各組的MTL-R表達(dá)陽性值及胃標(biāo)記物完全排空時間情況()Tab1 Motilin receptors and gastric emptying times of radiopaque markers in patients with liver cirrhosis and normal subjects()

表1 正常組和肝硬化各組的MTL-R表達(dá)陽性值及胃標(biāo)記物完全排空時間情況()Tab1 Motilin receptors and gastric emptying times of radiopaque markers in patients with liver cirrhosis and normal subjects()

分組 例數(shù) MTL-R表達(dá)(%) P值 胃標(biāo)記物完全排空時間(min) P值15 29.3 ±13.0 167.67 ±85.21有無肝硬化正常組 18 44.8 ±9.2 ＜0.05 166.77±62.54 ＜0.05肝硬化組 32 22.9 ±13.0 223.28 ±90.31有無黏膜病變有 PHG 組 17 17.3±10.3 ＜0.05 272.35±63.16 ＜0.05無PHG組

表2 正常組和肝硬化各組MTL-R表達(dá)及胃標(biāo)記物排空情況()Tab2 Motilin receptors and gastric emptying times of radiopaque markers in patients with liver cirrhosis and normal subjects()

表2 正常組和肝硬化各組MTL-R表達(dá)及胃標(biāo)記物排空情況()Tab2 Motilin receptors and gastric emptying times of radiopaque markers in patients with liver cirrhosis and normal subjects()

與正常組比較，*P ＜0.05

組別 例數(shù) MTL-R表達(dá)陽性值(%) 胃標(biāo)記物排空時間(min)18 44.8 ±9.2 166.77 ±62.54 Child A 組 11 35.4 ±7.8 181.09 ±87.92 Child B 組 11 23.3 ±7.9 230.45 ±85.42*Child C 組 10 8.8 ±5.2 261.80 ±86.64*P正常組＜0.05值

圖1 肝硬化組胃竇MTL-R表達(dá)(免疫組化100×);圖2 正常組胃竇MTL-R表達(dá)(免疫組化40×);圖3 2枚標(biāo)記物在胃中;圖4 2枚標(biāo)記物完全胃排空Fig1 MTL-R positive cells in antrum mucosa of patients with liver cirrhosis(immunohistochemistry 100×);Fig2 MTL-R positive cells in antrum mucosa of normal subjects(immunohistochemistry 40×);Fig3 The two radiopaque markers were in stomach;Fig4 The two radiopaque markers were out of stomach completely

2.4 MTL-R表達(dá)與胃排空的關(guān)系 MTL-R表達(dá)陽性值X與胃標(biāo)記物完全排空時間Y具有負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)是 －0.675，P ＜0.05，相關(guān)方程是 Y= －365.5X+315.4。

3 討論

1997年有學(xué)者[3]從人類基因組DNA文庫中克隆出與下丘腦和垂體促生長激素分泌激素(GHS)相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，將其中的一個成員命名為 GPR38，稱為“孤兒受體”。1999年 Feighner等[4]克隆并鑒定了“孤兒受體”為MTL-R。MTL-R[5]是一種G蛋白偶聯(lián)受體，分布于人的胃腸道[6-7]，可能在胃腸道的運(yùn)動中起到了調(diào)節(jié)作用。Ter Beek等[8]證實(shí)了MTL-R分布于正常人和炎癥性腸病患者的胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸的肌層和黏膜層中，其表達(dá)程度與炎癥程度無關(guān)。但還有學(xué)者[9]研究示三硝基苯磺酸誘發(fā)的兔結(jié)腸炎，結(jié)腸收縮減弱與MTL-R表達(dá)下調(diào)有關(guān)。有學(xué)者[10]研究了胰十二指腸切除術(shù)后患者M(jìn)TL-R表達(dá)與胃排空情況，發(fā)現(xiàn)患者術(shù)后胃排空延遲發(fā)生率降低，其原因是該術(shù)式保留了MTL-R分布密度較高的空腸段。本組發(fā)現(xiàn)胃竇黏膜腺體上皮細(xì)胞[8]中可檢測出MTL-R的表達(dá)，肝硬化組MTL-R表達(dá)降低，有PHG組表達(dá)降低，Child C組MTL-R表達(dá)明顯降低，可能由于胃黏膜充血水腫明顯，胃腺體上皮細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死加重，使得腺體上皮分泌 MTL-R減少而影響胃排空。

胃標(biāo)記物完全排空時間反映了受試者胃排空情況。學(xué)者[11-12]研究肝硬化患者胃排空延遲可能機(jī)制是與肝功能減退及門脈高壓相關(guān)。本組肝硬化組胃標(biāo)記物完全排空時間延長，有PHG組胃標(biāo)記物排空時間明顯延長，肝硬化Child-Pugh分級越高，胃排空障礙越明顯，可能機(jī)制為PHG胃黏膜水腫明顯，導(dǎo)致胃壁增厚，使得胃壁彈性下降，胃壁的順應(yīng)性下降，導(dǎo)致餐后的近端胃容受性擴(kuò)張[13-15]，導(dǎo)致胃排空延遲;同時本組胃動素受體表達(dá)陽性值與胃標(biāo)記物完全排空時間呈負(fù)相關(guān)，胃動素受體表達(dá)陽性值越低，胃排空延遲越明顯，說明肝硬化患者存在明顯的胃排空障礙，可能與MTL-R表達(dá)降低有關(guān)。除上述因素外，胃排空可能還受很多因素的影響，如年齡、性別、身體健康狀況、自主神經(jīng)功能障礙[16]及胃輕癱[2]等。

綜上所述，本研究表明，肝硬化組存在胃排空功能障礙，其原因可能與肝臟Child-Pugh分級、PHG、胃竇黏膜胃動素受體表達(dá)異常等多種因素相關(guān)。啟示在治療肝硬化腹脹時，從提高胃動素受體的敏感性出發(fā)，給予胃動素受體激動劑治療期望有效。

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