補腎益氣活血中藥對大鼠缺血再灌注腦組織血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)和血腦屏障通透性的影響

趙鳳玲 孫佳紅 張寶蘭 張秀梅

內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭 014030

尋求腦梗死的治療方法一直是世界醫(yī)學(xué)的焦點。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一類普遍存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長因子，又稱為血管通透性因子，具有刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移，促進(jìn)血管生成和增加血管通透性的作用[1]。VEGF直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原及內(nèi)皮細(xì)胞上的受體，發(fā)揮其促血管再生的作用[2]。目前認(rèn)為VEGF是最重要的成血管因子[3]。研究表明，VEGF是強效血管再生因子，VEGF可使血腦屏障（BBB）內(nèi)皮細(xì)胞間緊密聯(lián)接蛋白復(fù)合物的完整性破壞，從而引起B(yǎng)BB通透性增高，誘發(fā)腦水腫[4]。VEGF是主要的血管生成的調(diào)節(jié)介質(zhì)和一個強血管通透性因子。VEGF能夠開放BBB和介導(dǎo)腦水腫[5]。Davisa等[6]發(fā)現(xiàn)在VEGF表達(dá)后BBB有著明顯的開放，并得出了VEGF是通過提高表達(dá)VEGFR-2而實現(xiàn)開放血腦屏障的結(jié)論。本實驗研究旨在深入探討腦缺血再灌注后VEGF表達(dá)的動態(tài)變化與BBB破壞的關(guān)系，為VEGF臨床應(yīng)用前景提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 試驗動物

健康雄性Wistar大鼠80只，體重350～420 g，包頭醫(yī)學(xué)院實驗動物部提供（符合國家清潔級動物標(biāo)準(zhǔn)）。

1.2 試藥

血塞通注射液（昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，批號：12FB17），脈絡(luò)寧注射液（金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠，批號：20111023），10%水合氯醛，生理鹽水，4%多聚甲醛（PBS，0.1 mol，pH 7.4），甲酰胺，伊文思藍(lán)（Evans blue，EB），試劑盒（武漢博士德公司提供）。

1.3 儀器

熒光分光光度儀（960型，上海光學(xué)儀三廠），單尼龍線，水浴箱，石蠟切片機，光學(xué)顯微鏡。

1.4 試驗動物分組及模型制備

大鼠隨機分為假手術(shù)組8只，生理鹽水對照組36只（分別為缺血90 min再灌注1，3，7 d各12只）和中藥組36只（分組同生理鹽水對照組）。每小組中6只用于BBB通透性的測定，6只用于VEGF的檢測。大腦中動脈閉塞再灌注模型制作參照koizumis線栓法[7]。10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，頸部切口，分離左側(cè)的頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈及其分支，結(jié)扎頸外動脈及其分支，在頸內(nèi)動脈近端放線，遠(yuǎn)端放動脈夾，頸總動脈分叉處剪一小口，將直徑0.25 mm單尼龍線經(jīng)小口插入頸內(nèi)動脈（18±1）mm。尼龍線外留15～20 mm，線栓成功后移除遠(yuǎn)端動脈夾；再灌注時只需將栓線抽出至頸內(nèi)動脈起始部。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)是：栓線即刻出現(xiàn)左側(cè)Horner征，麻醉清醒后出現(xiàn)右前肢運動功能障礙。假手術(shù)組除栓線只插入0.5 cm左右外，余均同動物模型制備。中藥組給藥劑量按成人用量10 mL/60 kg，2次/d的10倍換算應(yīng)為1.67 mL/kg，2次/d，腹腔注射。生理鹽水組腹腔注射生理鹽水1.67 mL/kg，2次/d。

1.5 行為學(xué)檢查

參照Bederson等[8]的評分方法對大鼠進(jìn)行神經(jīng)癥狀評分。無神經(jīng)病學(xué)征象為0分；提尾時右側(cè)前肢不能完全伸直為1分；向右側(cè)旋轉(zhuǎn)征象為2分；向右側(cè)跌倒為3分；無自發(fā)活動及意識障礙者為4分。均于術(shù)后每日觀察。

1.6 血腦屏障通透性的定量測定[9-10]

使用EB作為測量血腦屏障通透性的標(biāo)蹤劑，各小組內(nèi)隨機取6只動物在處死前2 h按20 mg/kg體重自尾靜脈注入2%EB液。幾秒鐘后，大鼠眼球結(jié)膜，四肢等顯示藍(lán)色，表示注射成功。在預(yù)定的時間內(nèi)用250 mL生理鹽水進(jìn)行心臟灌注，迅速取左半球稱重后機械性粉碎腦組織標(biāo)本，按每100 mg濕腦組織加3 mL甲酰胺加蓋避光，在37℃水浴箱中提取72 h，提取液在熒光分光光度儀上測定熒光強度，激發(fā)波長624 nm，發(fā)射波長683 nm，波寬為10 nm。用倍比稀釋法制作EB標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出線性回歸方程，再根據(jù)線性回歸方程計算出提取液中EB的濃度，最后求得腦組織EB的含量，以μg/g濕腦組織表示。

1.7 VEGF表達(dá)檢測

到達(dá)各再灌注時間點后迅速以10%水合氯醛麻醉各組大鼠（每組中剩余的6只），經(jīng)左心室用生理鹽水沖洗，用 4%多聚甲醛（PBS，0.1 mol，pH 7.4）灌注固定腦組織，將腦組織浸于相同固定液中48 h。取視交叉平面作為觀察平面。石蠟包埋，以石蠟切片機切成4 μm厚的連續(xù)冠狀切片。每張切片分別計數(shù)高倍鏡下缺血區(qū)5個視野里陽性細(xì)胞數(shù)，取其均值為該張切片每高倍視野下陽性細(xì)胞數(shù)。VEGF免疫組織化學(xué)染色采用SABC法，按試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.8 腦組織病理學(xué)檢查

從各組織中隨機選取與用于免疫組化的切片相鄰的4張連續(xù)切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，在光鏡下觀察其組織形態(tài)學(xué)變化特點。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織血腦屏障的變化

2.1.1 肉眼觀察 假手術(shù)組左側(cè)半球未見藍(lán)染；生理鹽水組和藥物組左側(cè)半球（MCAO側(cè)）均有以大腦中動脈為圓心的藍(lán)染，藥物組藍(lán)染區(qū)顏色較淡。見表1。

表1 大鼠腦組織不同再灌注時間腦組織EB含量分析結(jié)果（μg/g濕腦組織）

2.1.2 腦組織中EB含量的檢測分析 在各再灌注時間點生理鹽水組和中藥組均與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），二者均呈現(xiàn)在缺血90 min再灌注24 h迅速升高，72 h達(dá)到高峰，以后開始減少，至少持續(xù)到缺血再灌注7 d以上。中藥組在各時間點均明顯低于生理鹽水組（P＜0.05）。

2.2 腦組織VEGF免疫組化染色結(jié)果分析

2.2.1 VEGF蛋白在腦組織中的分布 缺血側(cè)壞死與正常組織交界（缺血半暗帶）顯色最深，陽性細(xì)胞數(shù)目最多；VEGF陽性細(xì)胞為核周胞漿染色。在假手術(shù)組及模型組各組大鼠腦組織在雙側(cè)室管膜均存在少量VEGF表達(dá)，缺血中心區(qū)未能檢測到VEGF蛋白。病理圖片見圖1。

2.2.2 缺血區(qū)VEGF陽性細(xì)胞半定量分析結(jié)果 缺血90 min再灌注24 h半暗帶神經(jīng)元陽性反應(yīng)最明顯。達(dá)峰值后迅速減少，至再灌注3～7 d只有少數(shù)陽性細(xì)胞。假手術(shù)組皮層未能檢測到VEGF蛋白陽性細(xì)胞。見表2。

2.2.3 中藥對VEGF蛋白表達(dá)的影響 中藥在再灌注1～7 d對VEGF蛋白的表達(dá)沒有影響（P＞0.05）。

2.3 病理學(xué)觀察

組織病理學(xué)研究顯示：MCA區(qū)呈典型的腦缺血后壞死改變，以尾殼核外側(cè)部分損害最重，其次是背外側(cè)皮層，神經(jīng)元呈缺血性改變，胞體縮小胞核固縮，數(shù)量減少。膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生和少量白細(xì)胞滲出。毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹。病理圖片見圖1。

表2 大鼠腦組織不同再灌注時間缺血區(qū)免疫組化分析結(jié)果（個/高倍視野，×400）

2.4 癥狀變化

栓線即刻出現(xiàn)左側(cè)Horner綜合征，麻醉清醒后出現(xiàn)右前肢癱瘓。模型組動物偏癱癥狀評分均為在缺血再灌注3 d后趨于穩(wěn)定，逐漸降低。中藥組在3 d后較生理鹽水組評分降低（P＜0.005）。 見圖2。

3 討論

本實驗顯示腦缺血再灌注后血腦屏障破壞為一動態(tài)變化過程，在缺血再灌注1 d腦組織EB含量已明顯升高（P ＜ 0.001），72 h達(dá)高峰（與 1 d比較，P ＜ 0.05），這與臨床上大面積腦梗死病情多在3 d內(nèi)惡化相一致。因為血腦屏障破壞導(dǎo)致血管源性腦水腫，腦水腫加重是缺血性腦損傷病情惡化最主要的危險因素。故對能引起血腦屏障破壞的因素進(jìn)行深入討論進(jìn)而實施有針對性的治療成為缺血性腦血管疾病研究的熱點。

近年有關(guān)VEGF在缺血性腦組織中的表達(dá)調(diào)節(jié)及作用機制的研究迅速增多。VEGF在缺血性損傷后腦組織功能的保護(hù)和修復(fù)中的作用逐漸引起了人們的注意并已取得積極的研究進(jìn)展，許多實驗結(jié)果證實VEGF在抗腦缺血損傷中起著非常重要的作用。VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原，可以刺激體內(nèi)尤其是缺血部位的血管形成[11]。目前認(rèn)為，缺氧是VEGF/VEGFR表達(dá)的最主要的調(diào)節(jié)因素[12]。缺血、缺氧時，VEGF表達(dá)明顯增加，尤以腦組織中VEGF表達(dá)升高明顯。在腦缺血后的“缺血半暗帶”低氧區(qū)，低氧激活低氧誘導(dǎo)因子后促使VEGF及其受體VEGFR-1和VEGFR-2的表達(dá)，引起血管反應(yīng)，以血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新血管形成為特征，刺激缺氧組織建立有效的側(cè)支循環(huán)并恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，發(fā)揮搭橋作用，誘導(dǎo)新生血管形成，并使新生血管從正常組織向半暗帶及缺血中心區(qū)延伸，增加受累腦組織再灌注及供氧量，從而減輕腦缺血再灌注損傷[13]。但是VEGF可增加血管通透性，促使病變組織微血管內(nèi)血漿外滲，尤其對皮膚微血管通透性影響最明顯。國外已有少數(shù)研究涉及VEGF在卒中后腦水腫形成中的作用，但結(jié)果不盡一致。本實驗動態(tài)觀察了MCA閉塞后再灌注不同時間點BBB破壞和VEGF表達(dá)的動態(tài)變化，顯示腦組織EB含量在24 h升高明顯，72 h達(dá)高峰，其后逐漸回落。而VEGF在24 h達(dá)高峰，其后迅速下降，72 h已回落接近正常。從二者動態(tài)變化的時程上看BBB破壞并不是VEGF表達(dá)的結(jié)果。另外實驗結(jié)果還顯示：補腎益氣活血中藥能夠降低各再灌注時間點大鼠腦組織EB含量，維護(hù)血腦屏障，減輕神經(jīng)功能缺損癥狀，但對VEGF蛋白表達(dá)沒有影響，故從這兩方面實驗結(jié)果說明VEGF不是BBB結(jié)構(gòu)和功能破壞的重要介質(zhì)，VEGF未加重卒中后血管源性腦水腫。這為應(yīng)用外源性VEGF蛋白或基因治療缺血性腦損傷提供了實驗依據(jù)。中藥組大鼠的肢體活動改善在3 d后較生理鹽水組進(jìn)步，證明中藥正是通過改善BBB的功能，減輕血管源性腦水腫，進(jìn)而使肢體功能改善成為可能。應(yīng)用中醫(yī)中藥治療缺血性腦損傷是我國神經(jīng)科學(xué)工作者探索的一個方向，中藥作用的多途徑性似乎與缺血性腦損傷病理變化的多樣性具有針對性效應(yīng)，補腎益氣活血中藥在一定程度上能夠減輕BBB的破壞，臨床上可以安全使用，其BBB開放的機制及與其他促血管生成因子的關(guān)系仍需進(jìn)一步探討。

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