包頭地區(qū)漢族健康人群維生素D受體基因Tru9I多態(tài)性分析

王 鵬 周立社 賈彥彬

包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古包頭 014010

維生素D（Vitamin D）是人體一種必需的維生素，人體不能自行合成，需通過(guò)日曬或食物攝入獲得。維生素D本身無(wú)活性，需要在體內(nèi)經(jīng)過(guò)兩次羥化，轉(zhuǎn)化為1，25-二羥維生素 D3[1，25-（OH）2D3]才能發(fā)揮強(qiáng)大的生物效應(yīng)[1]。VDR與1，25-（OH）2D3結(jié)合后，該復(fù)合物可與靶基因上游啟動(dòng)子區(qū)或調(diào)控區(qū)域上的特定DNA序列相結(jié)合，進(jìn)而對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。VDR基因多態(tài)性分別對(duì)應(yīng)多個(gè)內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，目前已發(fā)現(xiàn)VDR基因含有5個(gè)限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP），分別是BsmI、ApaI、TaqI、FokI、Tru9I的酶切位點(diǎn)。 Tru9I多態(tài)性位點(diǎn)是 2000 年法國(guó)Ye等[2]首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的，它位于VDR第Ⅷ內(nèi)含子末端，發(fā)生G/A改變的多態(tài)性位點(diǎn)。Tru9I多態(tài)性位點(diǎn)雖然不改變VDR的蛋白序列，但轉(zhuǎn)錄出VDR基因的mRNA 3′末端區(qū)域可以影響mRNA的表達(dá)和穩(wěn)定性，影響增強(qiáng)子對(duì)靶部位的親和力。國(guó)外研究認(rèn)為T(mén)ru9I多態(tài)性與1型糖尿病[3]、直結(jié)腸腺癌等疾病及骨密度[4]相關(guān)。本文對(duì)VDR單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的研究，旨在了解本地區(qū)健康人群VDR基因Tru9I多態(tài)性分布特點(diǎn)，為更好地研究維生素D受體基因單核苷酸多態(tài)性與疾病的關(guān)系提供有價(jià)值的參考數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

樣本來(lái)自包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2009年1月～2011年12月的漢族健康體檢者，經(jīng)本人同意且在包頭市居住5年以上的人群為對(duì)象，從中選擇400人，男200人，女200人，年齡20～65歲，均排除有嚴(yán)重器質(zhì)性疾病、高血壓、糖尿病、內(nèi)分泌疾病、惡性腫瘤史者以及嚴(yán)重肝、膽、腎疾病等疾病者。

1.2 儀器和試劑

人外周血基因組DNA提取試劑盒，2×Taq PCR MasterMix（含染料），DNA Marker均為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖購(gòu)自北京賽百盛生物工程公司；溴化乙錠（EB）、TAE緩沖液等試劑購(gòu)于杭州博日公司；限制性內(nèi)切酶 Tru9I由紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司提供，濃度為10 000 U/mL；芬蘭進(jìn)口雷勃加樣器；日本三洋超低溫冰箱；LX-200型迷你離心機(jī)為海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 用EDTA抗凝管經(jīng)無(wú)菌操作抽取體檢者外周血3 mL，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA提取 嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒說(shuō)明操作，此試劑盒采用可特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和特殊的緩沖系統(tǒng)，能高效提取血液中的基因組DNA。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 引物參照同類研究[5]：上游引物：5′-GGC AACCTGAAGGGAGACGTA-3′； 下游引物：5′-CTCTTTGGACCTCATCACCGAC-3′，反應(yīng)的總體積 25 μL，含模板DNA 1.5 μL，兩端引物各 1 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9 μL。 PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min；然后 94℃變性 45 s，57℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，35 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，然后應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)分析，確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。VDR-Tru9I基因應(yīng)擴(kuò)增出461 bp的目的條帶。

1.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切 以上得到的擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Tru9I酶切。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL，加入1 μL 限制性內(nèi)切酶Tru9I（10 000 U/mL）及相應(yīng)的緩沖液，37℃水浴4 h。取5 μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)成像酶切產(chǎn)物。根據(jù)片段大小進(jìn)行基因型分析。分型標(biāo)準(zhǔn)為T(mén)T基因型：461 bp一個(gè)片段；Tt基因型：461 bp、361 bp、100 bp 三個(gè)片段；t基因型：361 bp、100 bp兩個(gè)片段。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，χ2檢驗(yàn)判斷Tru9I的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

經(jīng)限制性內(nèi)切酶Tru9I對(duì)PCR產(chǎn)物消化后電泳發(fā)現(xiàn)VDR基因存在多態(tài)性。VDR基因有兩個(gè)等位基因T和t，可組合形成 TT、Tt、tt 3 種基因型（圖1）。

2.2 包頭地區(qū)漢族健康人群VDR-Tru9I基因型與等位基因的頻率分布

見(jiàn)表1。

表1 包頭地區(qū)漢族健康人群VDR-Tru9I基因型與等位基因的分布頻率

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

為考察資料的可靠性，進(jìn)行VDR基因型分布的遺傳平衡檢驗(yàn)，結(jié)果基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），本研究人群具有群體代表性。

3 討論

VDR在體內(nèi)的生物學(xué)作用主要是介導(dǎo)Vit D的效應(yīng)細(xì)胞作用，VDR基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松的形成關(guān)系密切。Tru9I多態(tài)性位點(diǎn)位于第Ⅷ內(nèi)含子末端，發(fā)生了G/A改變，可影響mRNA水平和穩(wěn)定性，是一個(gè)功能性的SNP。相對(duì)于其他維生素D基因多態(tài)性位點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)其的研究較少。雖然最近國(guó)內(nèi)張麗婭等[5]對(duì)Tru9I進(jìn)行了研究，但其樣本局限于男性。本研究檢測(cè)了包頭地區(qū)400名漢族健康人群的VDR基因Tru9I多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布情況，結(jié)果顯示 TT、Tt、tt三種基因型頻率分別為44%、38%、18%。T等位基因占63%，t等位基因占37%。此結(jié)果與國(guó)外的報(bào)道有一定的差異[3，6]，而與國(guó)內(nèi)陳為堅(jiān)等[7]報(bào)道的大致接近。這可能由于東西方人群差異所造成，因此推論VDR基因Tru9I多態(tài)性的分布可能存在種族差異，且環(huán)境因素也可能會(huì)造成同一種族的基因頻率發(fā)生微小的變化。基因多態(tài)性的堿基的取代、缺失、插入而引起編碼序列的核苷酸順序改變，在轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)的過(guò)程中，造成遺傳密碼的改變、mRNA剪接異常、蛋白質(zhì)肽鏈中的片段缺失、或啟動(dòng)子的突變及非轉(zhuǎn)錄區(qū)的突變等。有的可以使基因的轉(zhuǎn)錄水平或活性增強(qiáng)或降低，并且對(duì)多肽鏈中氨基酸的排列順序產(chǎn)生影響?；蚨鄳B(tài)性的研究對(duì)于遺傳病是具有雙重意義的，首先，基因的有害突變，包括經(jīng)典的點(diǎn)突變和已知的動(dòng)態(tài)突變，都有可能成為生物體發(fā)病的根源，導(dǎo)致遺傳病的發(fā)生和發(fā)展；其次，基因多態(tài)性位點(diǎn)眾多，是很好的遺傳標(biāo)記，可以在遺傳病的研究和臨床診斷中發(fā)揮重要的作用。

隨著人類基因組計(jì)劃的迅猛進(jìn)展，研究基因組中的序列改變也就是人類DNA多態(tài)性成為必然，同時(shí)醫(yī)學(xué)界就此也達(dá)成共識(shí)，即不論是器質(zhì)性的疾病還是功能性的疾病，無(wú)論是軀體性的還是精神心理性的疾病，都有必要從基因水平上去探究其病因，以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)出新的治療方案，研究新的藥物。這些研究為群體遺傳學(xué)、藥物的開(kāi)發(fā)、法醫(yī)學(xué)、遺傳疾病的進(jìn)一步研究提供了巨大的推動(dòng)力。

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