依達(dá)拉奉對機械通氣所致大鼠急性肺損傷的保護作用

付 俊 鐘和英 鄭 敏 冉 然 肖 昀 顧俊峰 余開鋒

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院麻醉科，湖北十堰 442000

呼吸機相關(guān)性肺損傷（ventilation-induced lung injury，VILI）是機械通氣的常見并發(fā)癥，由于發(fā)病機制不清楚，目前臨床上缺乏有效的治療手段。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激在呼吸機相關(guān)性肺損傷的發(fā)生中具有十分重要的作用[1]。氧化應(yīng)激狀態(tài)下直接或間接產(chǎn)生的活性氧族（ROS）和活性氮族（NOS）介導(dǎo)了各種炎癥損傷，羥自由基（·OH）是ROS中化學(xué)性質(zhì)最活潑的基團，在誘導(dǎo)生物氧化應(yīng)激損傷中具有十分重要的作用[2-3]。依達(dá)拉奉是一種新合成的自由基清除劑，可以選擇性的清除羥自由基，具有抗炎和抗氧化作用，研究發(fā)現(xiàn)，其在對缺血再灌注損傷[4-5]、內(nèi)毒素（LPS）[6]和博萊霉素[7-8]誘發(fā)的肺損傷有潛在的治療作用中，具有明顯的保護作用，但其在呼吸機相關(guān)性肺損傷中的治療卻很少有研究涉及。本研究探討依達(dá)拉奉對大鼠呼吸機相關(guān)肺損傷的影響，旨在為呼吸機相關(guān)性肺損傷尋找新的更有效的治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料

戊巴比妥鈉（美國Sigma公司）；依達(dá)拉奉注射液（四川升和制藥有限公司，批號52028303）；多克隆抗鼠NF-κB亞基P65抗體（美國Santa Cruz公司）；髓過氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；LaminB1抗體（美國Santa Cruz公司）；Western blot全套系統(tǒng)（美國 Bio-Rad公司），Imager 5500凝膠成像儀（美國Alpha公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及標(biāo)本收集 清潔級雄性SD大鼠24只，體重280～320 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心提供，隨機分為 3 組（n=8）：對照組（C 組）行常規(guī)潮氣量（VT=8 mL/kg）機械通氣4 h；大潮氣量組（MV組）行大潮氣量（40 mL/kg）機械通氣4 h，呼吸頻率40次/min，氧濃度21%，呼氣末正壓通氣（PEEP）=0 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)； 大潮氣量+依達(dá)拉奉組（E組）經(jīng)股靜脈注射0.2%的依達(dá)拉奉（批號：H20031342，先聲制藥，江蘇）15 mg/kg后 30 min 行大潮氣量機械通氣，參數(shù)設(shè)定同MV組。C組和MV組于上述相應(yīng)時間點經(jīng)股靜脈注射等量生理鹽水。MV組和E組大鼠腹腔注射20%烏拉坦1.3 g/kg麻醉后，直視下應(yīng)用額鏡經(jīng)口氣管插管（16G×211的靜脈套管針代替氣管導(dǎo)管），口腔填塞細(xì)紗布條以防止漏氣，連接683型小動物容量控制呼吸機（Harvard Apparatus公司，美國）機械通氣，調(diào)節(jié)潮氣量40 mL/kg，呼吸頻率40次/min，氧濃度 21%，PEEP=0 cm H2O，通氣時間4 h。以24G動脈穿刺針行股靜脈置管，靜脈輸注乳酸鈉林格液3 mL/h。以24G動脈穿刺針行頸動脈置管，由1205A監(jiān)護儀（HP公司，美國）監(jiān)測心率和平均動脈壓。整個過程大鼠保持仰臥位，通氣結(jié)束后頸動脈放血處死大鼠。動物處死后立即開胸，分離右肺上葉，濾紙吸干肺表面水分，精確稱重后，置于70℃烤箱烘烤至恒重，計算肺濕/干重比（W/D）。取部分右肺下葉，4%多聚甲醛浸泡，持續(xù)真空抽吸至沉淀固定，經(jīng)HE染色后，光鏡下觀察病理學(xué)。剩余新鮮肺組織液氮速凍，錫紙包裹后置于-80℃冰箱中保存以制備組織勻漿。

1.2.2 檢測指標(biāo)及方法 ①肺組織勻漿中檢測指標(biāo)：采用比色法測定MPO，硫代巴比妥酸法測定MDA；黃嘌呤氧化酶法測定SOD，具體步驟按試劑盒說明書進行。②肺組織W/D測定：取右肺上葉，濾紙吸干肺表面水分，精確稱重后，置于70℃烤箱烘烤至恒重，計算肺濕/干重比（W/D）。③肺組織病理觀察：留取右肺下葉，4%多聚甲醛浸泡固定48 h，常規(guī)脫水，透明，浸臘，包埋，切片機常規(guī)切成5 μm的石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察組織病理形態(tài)變化。④肺組織NF-κB p65蛋白的表達(dá)：采用Western blot法測定肺組織細(xì)胞核NF-κB p65蛋白的表達(dá)，以表示NF-κB的活性。稱取液氮凍存的肺組織100 mg，加入細(xì)胞核蛋白蛋白抽提試劑1 mL，提取核蛋白。將樣品蛋白和2×樣品緩沖液以1∶1混勻，100℃煮沸5 min，冷卻后依次加到樣品槽中。在穩(wěn)壓狀態(tài)下SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以200 mA恒流電泳2 h轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)移膜用封閉液在室溫下封閉2 h。洗膜后用多克隆兔抗鼠NF-κB亞基P65抗體（1∶500，Santa Cruz公司，美國）孵育過夜，洗膜后用辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔的IgG二抗（1∶5000，福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品）室溫孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法檢測陽性信號，內(nèi)參為LaminB1。采用光密度掃描儀計算積分光密度，取與LaminB1的比值反映肺組織細(xì)胞核NF-κB p65蛋白的相對水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理形態(tài)學(xué)變化

C組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁光滑，肺泡間隔薄，且均勻一致，肺泡腔中無滲出液。MV組肺泡間隔水腫增厚，肺泡腔內(nèi)可見明顯的出血、滲出，間質(zhì)水腫以及中性粒細(xì)胞浸潤，部分肺泡萎陷不張；與MV組相比，E組中肺組織肺泡間隔清晰，肺泡腔內(nèi)的出血、滲出以及中性粒細(xì)胞浸潤顯著減輕。見圖1～3。

2.2 肺組織W/D、勻漿中MPO和MDA含量、SOD活性的變化

機械通氣4 h后，MV組和E組大鼠肺組織W/D、MPO、MDA含量顯著高于C組（P＜0.05），SOD活性較C組明顯降低（P＜0.05）；機械通氣 4 h后，E組 W/D、MPO、MDA含量顯著低于MV組（P＜0.05），SOD活性顯著高于MV 組（P ＜0.05）。 見表1。

表1 肺組織W/D、MPO和MDA含量、SOD活性的變化（±s，n=8）

表1 肺組織W/D、MPO和MDA含量、SOD活性的變化（±s，n=8）

注：與 C組比較，*P＜0.05；與MV 組比較，#P＜0.05；MPO：髓過氧化物酶；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；W/D：肺濕/干重比

SOD/mg prot）E組5.7±0.42.36±0.152.93±0.30 94.3±10.5 47.8±9.8*72.6±10.3*#

2.3 肺組織NF-κB p65蛋白的表達(dá)

機械通氣4 h后，MV組肺組織核蛋白NF-κB p65蛋白的表達(dá)顯著高于C組（P＜0.05）；機械通氣4 h后，E組肺組織核蛋白NF-κBp65蛋白的表達(dá)顯著低MV組（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

機械通氣在ICU危重患者搶救中具有無可替代的作用。在ICU的患者中，30%的患者需要進行機械通氣。自Webb等[9]于1974年首次提出VILI以來，眾多學(xué)者從人類研究、動物模型、離體器官和細(xì)胞學(xué)等多個方面來探索機械通氣肺損傷的發(fā)病機制，其中VILI動物模型研究最能體現(xiàn)機械刺激引起的肺部改變在整個機體環(huán)境中的發(fā)展變化。目前認(rèn)為大潮氣量合并無呼吸末正壓（PEEP=0）的通氣是復(fù)制VILI最簡單有效的方法，也是現(xiàn)在最常用的研究VILI的方法。因此，本實驗也采用大潮氣量機械通氣的方法建立VILI模型。在臨床上，需要機械通氣輔助治療的患者往往肺部已有嚴(yán)重病變，此類患者肺組織病變程度不均使得患者肺順應(yīng)性不一致，機械通氣時，順應(yīng)性好的肺組織受力大于有病變的肺單位，病變周圍正常肺組織遭受的跨肺壓約是正常的4.5倍[10]。有研究表明[11]，呼吸窘迫綜合征患者采用VT 10～12 mL/kg進行機械通氣時，對于周圍未損傷的肺組織來說，其作用力相當(dāng)于給予VT 38～50 mL/kg通氣時的機械力刺激，極易使正常肺組織受損，導(dǎo)致VILI。大鼠的正常潮氣量是7～10 mL/kg[12]，接近人類的潮氣量。故本實驗在參考既往相關(guān)的實驗研究的基礎(chǔ)上[13-15]，采用40 mL/kg的潮氣量對正常大鼠的肺組織施行機械通氣，使其更好地模擬臨床上治療ARDS等肺部有病變患者機械通氣誘發(fā)的肺損傷的過程，且本實驗發(fā)現(xiàn)，該潮氣量通氣4 h后，大鼠的肺組織病理呈現(xiàn)肺水腫等典型的VILI改變，證實了模型的成功。

研究表明，VILI時機體內(nèi)存在氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的失衡[16]。VILI時肺內(nèi)的ROS主要來源于中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[16]。生理情況下體內(nèi)可產(chǎn)生少量活性氧，其具有殺菌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及維持體內(nèi)氧化還原的平衡，并可以被體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)所清除，兩者之間保持一種動態(tài)平衡狀態(tài)。病理狀態(tài)下，活化的炎癥細(xì)胞產(chǎn)生大量的，雖然其活性很弱，但是在SOD的作用下生成H2O2，后者在金屬離子（鐵離子或銅離子）共同作用下可通過Fenton和Haber-Weiss反應(yīng)被還原成活性更強和毒性更強的·OH，從而導(dǎo)致機體受損?！H是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧，也是ROS中誘導(dǎo)生物損傷最重要的成分。吞噬細(xì)胞中活化的嗜苯胺藍(lán)顆?？舍尫臡PO，后者也可以作為中性粒細(xì)胞浸潤的證據(jù)。由于氧自由基活性高，性質(zhì)不穩(wěn)定，半衰期短，很難直接測量其含量，而通過測量其氧化產(chǎn)物的含量則可間接反映其生成情況。丙二醛（MDA）是氧自由基作用于細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，丙二醛的測定可間接反映體內(nèi)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度。SOD是體內(nèi)最重要的自由基清除酶，其活性變化可反映體內(nèi)抗氧化功能情況。通過觀察SOD和MDA指標(biāo)的變化，可以反映氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生程度。本研究中，MV組在機械通氣4 h后，肺組織W/D明顯高于C組，顯微鏡下觀察可見明顯肺損傷，同時肺組織MPO、MDA含量均顯著升高，SOD活性顯著降低，說明MV組的肺組織中有較多的吞噬細(xì)胞浸潤，釋放大量的ROS引起氧化應(yīng)激，造成肺損傷。

NF-κB是一種能與多種基因啟動子或增強子κB序列（GGGACTTTC）特異結(jié)合的核蛋白因子，通常是由p50/p65構(gòu)成的異源二聚體，其中p65羧基端含有多個反式激活結(jié)構(gòu)域，可調(diào)節(jié)與免疫、炎癥等有關(guān)的多種基因表達(dá)。在靜息狀態(tài)下，NF-κB與IκB家族中的一個抑制性蛋白相結(jié)合，以無活性的形式存在于細(xì)胞漿。在前炎癥細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、凋亡介質(zhì)等的刺激下NF-κB抑制因子IκB發(fā)生磷酸化而降解，使NF-κB游離、活化并進入細(xì)胞核，與不同的靶基因的啟動子或增強子內(nèi)特異的同源結(jié)合序列結(jié)合，啟動和調(diào)控參與炎癥反應(yīng)的炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、MIP-2、ICAM-1等）的基因表達(dá)。反過來，體內(nèi)增多的炎癥介質(zhì)、ROS等又可以激活NF-κB，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致炎癥級聯(lián)擴大。也就是說致病因素激活NF-κB后，引起ROS等釋放，ROS又可以正反饋激活NF-κB，造成炎癥級聯(lián)放大，加重肺損。大量的文獻(xiàn)顯示[17-20]細(xì)胞核NF-κB p65的活化在VILI中發(fā)揮重要作用。本實驗采用Western Blot測定細(xì)胞核NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平，以此反映NF-κB的激活程度。本實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，大潮氣量組（MV組）細(xì)胞核NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平明顯增多，提示NF-κB被激活，除與直接的機械刺激有關(guān)，可能還與ROS的產(chǎn)生，進一步激活NF-κB有關(guān)。

由于氧化應(yīng)激在機械通氣肺損傷的發(fā)病機制中起著重要作用，目前對應(yīng)用抗氧化劑治療VILI的研究已成為國內(nèi)外研究熱點之一。既往實驗研究顯示，N-乙酰半胱氨酸、褪黑素、香莢蘭乙酮（NADPH氧化酶抑制劑）、魚藤酮（線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ抑制劑）、氫氣、別嘌呤醇等抗氧化劑在VILI動物模型中具有良好的保護作用，但是遺憾的是這些藥物在臨床試驗中不一定有效。因此尋求新的臨床有效治療VILI的藥物迫在眉睫。依達(dá)拉奉是目前全球進入三期臨床使用的最新型強抗氧化劑，其主要是通過提供電子直接清除·OH、過氧亞硝酸陰離子（ONOO-）、單線態(tài)氧（1O2）等強細(xì)胞毒性自由基，抑制脂質(zhì)過氧化。該藥具有親脂性、易滲透入組織、靜脈使用后可以保持有效的組織內(nèi)藥物水平等良好的藥理性質(zhì)[21]。參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]報道及預(yù)實驗結(jié)果，筆者選擇靜脈注射依達(dá)拉奉15 mg/kg作為治療劑量進行實驗。本研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉干預(yù)可以減輕大鼠膿毒性肺損傷病理改變，降低肺組織內(nèi)MPO、MDA含量和肺組織W/D，增加SOD含量，說明應(yīng)用依達(dá)拉奉后對VILI發(fā)揮了保護作用。其可能的機制為通過清除ROS，切斷ROS對NF-κB正反饋過程，降低了NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，從而減輕了因NF-κB活化而引起的炎癥級聯(lián)放大效應(yīng)，達(dá)到保護VILI的目的。

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