五味子醇提取物減輕丙戊酸鈉肝毒性及協(xié)同抗癲癇作用研究

金 戈 于洪娟 朱美達 王俊平 郝 偉

沈陽醫(yī)學院藥理教研室，遼寧沈陽 110034

丙戊酸鈉是臨床常用的廣譜抗癲癇藥，具有療效高、安全性好、很少影響患者認知功能的藥效特點。但丙戊酸鈉的藥動學和藥效學個體差異很大，劑量難以掌握。而當其血藥濃度＞100 g/L時，其毒副作用增加而藥效卻無明顯增強[1]。尤以肝臟損傷最令人關注。肝毒性主要通過抑制糖異生、抑制β-脂酸氧化、抑制細胞色素P450等主要作用使肝酶類增加[2-3]。臨床資料表明，服用丙戊酸鈉的患者中15%～30%在服藥后出現(xiàn)血清中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）及乳酸脫氫酶等肝酶活性的升高[4-5]。五味子是多年生落葉藤本，屬木蘭科，可做藥用。其主要保肝成分五味子乙素（Schisandrin B，Sch B），是從五味子果仁中提取的有效成分，具有顯著的肝臟保護作用，是多種保肝降酶中成藥的主要成分[6]。其保肝機制多認為是通過清除自由基、誘導肝細胞色素P450從而增強肝臟的解毒功能、促進肝臟蛋白質和糖原合成、改善線粒體抗氧化狀態(tài)，但是確切機制尚不明確[7-8]。另有研究數(shù)據(jù)顯示五味子具有明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用，這也是其中醫(yī)臨床用于心悸失眠的現(xiàn)代理論依據(jù)。其對于改善睡眠具有顯著效果且不產(chǎn)生藥物依賴性[9]，有廣泛的中樞抑制作用，并有安定藥的特點[10]。因此本研究旨在探討五味子醇提取物減輕丙戊酸鈉肝毒性的作用及其機制，進一步探討五味子醇提取物協(xié)同抗癲癇的作用，為臨床癲癇病的治療提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

半自動生化儀，型號：RT1904C。酶標定量測試儀：奧地利特TECAN公司，型號：F039003。

1.2 藥品及試劑

五味子醇提取物：沈陽醫(yī)學院藥理教研室提供；丙戊酸鈉：山東仁和堂藥業(yè)有限公司，批號：20090221；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化歧化酶（SOD）的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 動物

昆明種小鼠120只，體重25～30 g，健康，雌雄各半，由沈陽藥科大學動物實驗中心提供。

2 方法與結果

2.1 實驗動物分組及給藥方法

實驗動物40只，雌雄各半，隨機分成4組：空白對照組，模型組，五味子醇提取物低劑量組（五味子低劑量組），五味子醇提取物高劑量組（五味子高劑量組），每組10只。適應性喂養(yǎng)3 d后，給藥方式：對照組給予生理鹽水；模型組給予丙戊酸鈉 80 mg/（kg·d）（造模劑量預實驗獲得）；五味子醇提取物低劑量組給予丙戊酸鈉同時給五味子醇提取物50 mg/（kg·d），五味子醇提取物高劑量組給予丙戊酸鈉同時給五味子醇提取物100 mg/（kg·d）；連續(xù)灌胃給藥14 d。實驗期間各組小鼠置于安靜環(huán)境分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，每天稱量體重，觀察動物進食及活動情況。

2.2 血清中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）含量的檢測

實驗動物于給藥后禁食12 h。眼球采血置于帶抗凝劑的EP管中，檢測ALT、AST指標，評價五味子醇提取物減輕丙戊酸鈉的肝臟毒性作用。

2.3 ELISA檢測肝組織中GSH-Px、SOD含量

取各組肝組織100 mg，加入生理鹽水900 μL，機械勻漿。靜置 10 min后，4℃，3000 r/min，離心15 min后取上清液。制備標準曲線，檢測肝組織中GSH-Px，SOD含量。

2.4 五味子醇提取物的協(xié)同抗癲癇作用

取小鼠80只，雌雄各半原則，隨機分為模型對照組，五味子醇提取物組（五味子組），丙戊酸鈉組，丙戊酸鈉聯(lián)合五味子醇提取物組（丙戊酸鈉加五味子組）。按照組別給藥：模型對照組給予生理鹽水；五味子組給予五味子醇提取物100 mg/（kg·d）；丙戊酸鈉組給予丙成酸鈉 80 mg/（kg·d）；丙戊酸鈉加五味子組給予丙戊酸鈉加五味子醇提取物100 mg/（kg·d），連續(xù)給藥 7 d，于第 7 天經(jīng)腹腔注射氯化鋰（127 mg/kg），24 h 后注射硫酸阿托品（1 mg/kg），30 min 后再注射匹羅卡品（300 mg/kg）。觀察小鼠出現(xiàn)明顯的肢體陣攣、強直及跌倒等癲癇癥狀。按照經(jīng)典的Racine癲癇發(fā)作行為標準進行癲癇的行為學評價[11]。

2.5 統(tǒng)計學方法

實驗結果采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析。兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料采用確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.6 結果

2.6.1 五味子醇提取物對肝酶的影響 結果顯示，與空白對照組比較，模型組ALT、AST升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，五味子高劑量組ALT、AST降低明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各組白細胞（WBC）變化不明顯。見表1。

表1 五味子醇提取物處理后各組的小鼠ALT、AST、WBC含量（±s）

表1 五味子醇提取物處理后各組的小鼠ALT、AST、WBC含量（±s）

注：與空白對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；ALT：丙氨酸氨基轉移酶；AST：天冬氨酸氨基轉移酶；WBC：白細胞

組別 只數(shù) ALT（U/L） AST（U/L） WBC（×109/L）空白對照組模型組五味子低劑量組五味子高劑量組10 10 10 10 37.40±7.62 77.01±11.38#70.30±11.05 45.60±10.54*132.80±23.02 219.60±49.94#215.70±40.01 154.60±33.46*5.98±0.31 6.00±0.26 5.94±0.21 5.98±0.24

2.6.2 五味子醇提取物對血清酶的影響 結果顯示，與空白對照組比較，模型組SOD、GSH降低明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，五味子高劑量組SOD、GSH升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 五味子醇提取物作用后各組小鼠肝組織SOD、GSH含量變化（±s）

表2 五味子醇提取物作用后各組小鼠肝組織SOD、GSH含量變化（±s）

注：與空白對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；SOD：谷胱甘肽過氧化物酶；GSH：超氧化歧化酶

組別 只數(shù) SOD（U/mL） GSH（g/L）空白對照組模型組五味子低劑量組五味子高劑量組9999 5.47±1.14 2.63±0.79#2.99±0.71 4.50±1.16*55.97±7.41 32.68±6.85#36.26±6.60 47.53±5.11*

2.6.3 五味子醇提取物協(xié)同抗癲癇作用 結果顯示，與模型組比較，丙戊酸鈉加五味子組Ⅳ級、Ⅴ級動物比例明顯降低（P ＜ 0.05）。 見表3。

表3 丙戊酸鈉與五味子醇提取物的協(xié)同抗癲癇作用[n(%)]

3 討論

丙戊酸鈉作為臨床上以應用多年的廣譜抗癲癇藥，可導致嚴重的肝損傷甚至肝衰竭[11]。其機制可能是：大量丙戊酸鈉影響肝細胞正常代謝，使細胞內產(chǎn)生自由基及自由基樣物質，產(chǎn)生過氧反應，進而造成肝細胞破壞和肝臟功能障礙[12]。五味子富含多種保肝成分[13]，其主要機制包括：清除肝臟代謝中產(chǎn)生的自由基，抑制脂質過氧化作用，進而保護肝細胞免受自由基損傷[8]。研究表明五味子對ALT升高的調節(jié)有獨特作用[14]。五味子多糖明顯降低老年大鼠血清丙二醛（MDA）含量，并提高老年大鼠血清SOD、過氧化氫酶（CAT）和GSH-Px活性，提示五味子多糖具有改善體內自由基代謝紊亂的作用[15-16]。Leong等[17]發(fā)現(xiàn)，五味子乙素能明顯激活AML12細胞中ERK1/2及Nrf2，從而激活MAPK通路，最終使谷胱甘肽的表達增強，阻斷氧化劑促凋亡效果。實驗證明，癲癇發(fā)作時引起神經(jīng)元異常放電的內向電流主要是Ca2+內流[17]，當Ca2+通道通透性增加時，Ca2+大量內流，引起神經(jīng)細胞持續(xù)較長的去極化反應及陣發(fā)性去極化漂移或稱爆發(fā)性放電，誘發(fā)癲癇發(fā)作。有研究報道五味子乙素可調節(jié)神經(jīng)元的同步放電，抑制神經(jīng)細胞內鈣離子濃度[18]。五味子提取物能明顯減少小鼠活動次數(shù)，有明顯鎮(zhèn)靜作用。此外五味子提取物還能增加小鼠睡眠次數(shù)，延長睡眠時間[19]。為五味子的協(xié)同抗癲癇作用提供理論依據(jù)。

為了進一步探討五味子減輕丙戊酸鈉引起的肝損傷的作用，本實驗采用五味子乙醇提取物連續(xù)灌胃給藥后檢測血清及肝組織中相應指標的方法來驗證其保肝作用。結果表明測定GSH-Px的含量一定程度上可以評價肝臟損傷受到氧應激和脂質過氧化損傷的程度。五味子醇提取物可能通過增加肝組織中GSH-Px及SOD的含量產(chǎn)生抗氧化作用，降低血清中的AST和ALT的含量，而達到保肝的作用。另外，匹羅卡品造模致癲癇的實驗顯示，丙戊酸鈉加五味子醇提取物組Ⅳ級以上癲癇發(fā)作的動物只數(shù)明顯低于模型對照組。然而對五味子作用機制的全面闡述還有待進一步研究。

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