土壤及畜禽糞肥中四環(huán)素類抗生素固相萃取—高效液相色譜法的優(yōu)化與初步應(yīng)用

張志強， 李春花， 黃紹文*， 高 偉， 唐繼偉

(1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室，北京 100081;2 天津市農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，天津 300192)

土壤及畜禽糞肥中四環(huán)素類抗生素固相萃取—高效液相色譜法的優(yōu)化與初步應(yīng)用

張志強1， 李春花1， 黃紹文1*， 高 偉2， 唐繼偉1

(1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室，北京 100081;2 天津市農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，天津 300192)

四環(huán)素類抗生素殘留; 土壤; 畜禽糞便; 固相萃取—高效液相色譜法

Abstract: Tetracyclines(TCs) are the most commonly detected antibiotics reminded in soils and manures in China. The survey of the residual status of tetracyclines is important for evaluating possible biological risks caused by direct exposure of bioorganisms and human beings. In this study, Analytical methods of three kinds of tetraclyinces, oxytetracycline, tetracycline and chlortetracycline, is optimized using SPE-HPLC. The residual status of TCs in soils and manure in Tianjin was investigated using the optimized method. The obtained method recovery rates for soils and manure are increased to the range of 52%-95%. In the surveyed feces samples from intensive piggeries and poultries, CTC is detected in 78% of manures with the highest mg/kg, and OTC and TC are detected in 56% of feces with the highest values of 34.8 and 22.7mg/kg, respectively. TCs are also detected in the market manure in Tianjin with similar residual levels and percentages to those in the feces samples. The total percentage of garden soils containing detectable TCs is 64% of the surveyed soils, and those for OTC, TC and CTC are 18%, 36% and 32%, respectively. The highest values for OTC, TC and CTC are 105.6, 196.7 and 477.8 μg/kg in dry weight respectively. The residual levels in soils under facilities are higher than those in open fields. In 25% of surveyed garden soils, the total amounts of three kinds of TCs are higher than those in the trigger lines causing biological safety.

Keywords: tetracyclines residue; soil; manure; SPE-HPLC

1 材料與方法

1.1 供試設(shè)備與試劑

本研究使用Agilent 1100型高效液相色譜儀(Agilent Technologies公司)， 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18，3.5 μm，4.6 mm×150 mm(Agilent Technologies公司); VisiprepTM-DL型固相萃取裝置(Supelco公司); SK8200HP超聲波器(中國上海); N-EVAP111氮吹儀(中國北京); 低溫離心機(Sigma公司); MS2 Minishaker渦旋混合器(中國廣州); 0.22 μm 濾膜(天津津騰); Bond Elut-SAX固相萃取小柱(500 mg/6mL，Agilent Technologies公司)，Poly-Sery HLB 固相萃取小柱(500 mg/6mL，CNW Technologies公司)。

甲醇、 乙腈和丙酮為HPLC級(Fisher公司); 磷酸氫二鈉、 檸檬酸、 乙二胺四乙酸二鈉、 草酸和三氯乙酸為分析純(國藥公司); 四環(huán)素、 土霉素和金霉素純度大于等于99%(Sigma公司); 溶液配制及洗脫等所用水均為二次蒸餾水。

McIlvaine緩沖溶液: 將625 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液與1000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液混合，用NaOH或HCl調(diào)pH = 4.0±0.05。

0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine緩沖溶液: 稱取60.50 g乙二胺四乙酸二鈉放入1625 mL McIlvaine緩沖溶液中，使其溶解，搖勻。

TCs混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液: 精確稱取0.100 g 土霉素(OTC)、 0.100 g四環(huán)素(TC)和0.200 g 金霉素(CTC)，定容于100 mL甲醇中，即得含有濃度為1000 mg/L OTC、 1000 mg/L TC和2000 mg/L CTC的儲備液。用混合流動相將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋100倍，得到含有10 mg/L OTC、 10 mg/L TC和20 mg/L CTC的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2 土壤和有機肥樣品的采集

糞肥樣品采自天津蔬菜基地附近的9個畜禽養(yǎng)殖場，包括雞糞樣5個、 豬糞樣4個。在每個糞堆表層0—30 cm和中層30—50 cm各選5個點采集糞肥，混勻后按照四分法取0.5 kg作為該養(yǎng)殖場的糞肥樣品，在-20℃條件下避光保存。商品有機肥為市售商品有機肥，從每種商品有機肥包裝袋內(nèi)5個不同位置采樣，混勻后按照四分法取0.5 kg作為供試樣品。土壤和有機肥樣品風(fēng)干粉碎后過1 mm篩待用，并測定含水量。

1.3 土壤和有機肥樣品的測定

土壤和有機肥樣品的處理基本依照孫剛[19]的方法: 稱取3.00 g土樣或豬、 雞糞樣品1.00 g置于50 mL離心管，加入10 mL 提取液，渦旋1 min后超聲提取10 min，于4 ℃、 4500 r/min條件下離心10 min，收取上清液; 沉淀部分再加入8 mL、 6 mL提取液重復(fù)以上提取過程兩次，合并三次上清液，在40℃下氮吹濃縮至12 mL左右。糞樣提取上清液中加入1 mL 10%三氯乙酸溶液搖勻后，靜置30 min后濃縮。固相萃取(SPE)小柱(土樣只用HLB小柱、 糞樣用SAX小柱與HLB小柱串聯(lián))依次加入5 mL甲醇、 5 mL二次蒸餾水活化。土壤、 有機肥提取液在真空條件下以流速約1 mL/min全部通過SPE小柱后，用5 mL 5%甲醇水溶液淋洗小柱，并真空抽干10 min。以5 mL洗脫液洗脫小柱，收集該洗脫液并在40 ℃下氮吹濃縮至0.5 mL以下，用混合流動相(0.01 mol/L草酸溶液-乙腈-甲醇的體積比為76-16-8)定容到1 mL，過0.22 μm濾膜后轉(zhuǎn)移至上機瓶，用HPLC測定3種抗生素含量。流動相和洗脫程序根據(jù)實驗優(yōu)化結(jié)果確定， 流速為1.0 mL/min、 柱溫為25 ℃、 檢測波長為355 nm、 進樣量為20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究采用Microsoft Excel 2003 和SPSS16.0進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)間的差異顯著性用Duncan新復(fù)極差法檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法的優(yōu)化

2.1.1 色譜儀參數(shù)的優(yōu)化 TCs的流動相一般由緩沖溶液與有機溶劑按一定比例混合組成，0.01 mol/L 草酸溶液是最常用的水相，乙腈和甲醇由于紫外吸收較低，是最為常用的有機溶劑[7,21]。已報道的0.01 mol/L草酸溶液-乙腈-甲醇比例有75-25-0[22]、 79-10.5-10.5[22]、 76-19-5[23]和76-16-8[19]。本實驗用OTC、 TC和CTC的加標(biāo)濃度分別為10、 10和20 mg/L的TCs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液對這幾種比例的流動相進行了比較。流動相中不含甲醇，OTC和TC不能基線分離(圖1a); 乙腈和甲醇同時做有機相且比例相同時，3種抗生素分離效果較好但響應(yīng)值較低(圖1b); 乙腈和甲醇比例為19 ∶5時，OTC和TC的峰形較差(圖1c); 乙腈和甲醇比例為2 ∶1時能實現(xiàn)兩者的互補，3種抗生素信號峰分離清晰且響應(yīng)值較高。所以選擇三者比例為76-16-8的流動相用于HPLC的測定。

2.1.2 土壤和有機肥樣品萃取方法的優(yōu)化

1) 提取液的確定 本研究對比了0.1 mol/L的Na2EDTA-McIlvaine緩沖溶液(以下簡稱緩沖溶液)、 緩沖溶液/甲醇等體積混合和緩沖溶液/丙酮(含20%的0.01 mol/L草酸甲醇)等體積混合(圖3中依次用A、 B和C表示，每種提取液做4次重復(fù))對提取效率的影響。結(jié)果表明，緩沖溶液中加入甲醇或者丙酮都可以顯著提高土壤中OTC、 TC和CTC的回收率，加入甲醇可分別提高15.6、 13.2和16.3個百分點，加入丙酮可分別提高16.7、 24.6和20.0個百分點。加入甲醇和丙酮的提取效果相差不大，但由于提取液中加入的有機溶劑需要在上柱之前采用氮吹濃縮法除去，因此有機溶劑的揮發(fā)特性大大影響著濃縮過程的快慢。丙酮的揮發(fā)性明顯強于甲醇，且極性比甲醇弱，對腐植酸的溶解性也較小[25]，因此選擇在提取液中加入等體積丙酮(含20%的0.01 mol/L草酸甲醇)作為優(yōu)化的提取緩沖液。

圖1 不同流動相比例TCs標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of tetracyclines obtained in 4 kinds of mobile phases[注(Note): a—0.01 mol/L的草酸溶液/乙腈=70/30 0.01 mol/L dicarboxyl-acetonitril (V/V=70/30); b—0.01 mol/L的草酸溶液/乙腈/甲醇=79/10.5/10.5 0.01 mol/L dicarboxyl-acetonitril-methanol (V/V/V=79/10.5/10.5); c—0.01 mol/L的草酸溶液/乙腈/甲醇=76/19/5 0.01 mol/L dicarboxyl-acetonitril-methanol (V/V/V=76/19/5); d—0.01 mol/L的草酸溶液/乙腈/甲醇=76/16/8 0.01 mol/L dicarboxyl-acetonitril-methanol (V/V/V=76/16/8) .]

圖2 加標(biāo)土壤、 糞樣的TCs色譜圖Fig.2 Chromatograms of tetracyclines in spiked soil and manure samples[注(Note): A—土壤樣品Soil sample; B—豬糞樣品Swine manure sample; C—雞糞樣品Chicken manure sample.]

圖3 不同提取液對土壤中TCs的提取效率Fig.3 Recoveries of tetracyclines extracted with different buffer solutions in soils[注(Note): A—0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine緩沖溶液 0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine buffer solution; B—0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine緩沖溶液/甲醇等體積混合 Equivalent volume mixture of 0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine buffer solution and methanol; C—0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine緩沖溶液與丙酮(含20%的0.01mol/L草酸甲醇)等體積混合Equivalent volume mixture of 0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine buffer solution and acetone (containing 20% of 0.01 mol/L dicarboxyl in methanol). 柱上不同字母表示不同提取液間提取效率在5%水平差異顯著Different letters above the bars mean significant at the 5% level.]

2) 洗脫液的選擇 本實驗對比了0.01 mol/L草酸甲醇和丙酮(含20%的0.01 mol/L草酸甲醇)兩種洗脫液的效果(圖4)。前者的OTC、 TC和CTC回收率分別為96.0%、 90.8%和91.6%，后者的回收率分別為99.1%、 98.4%和91.3%，兩者差異不明顯。但是丙酮的極性比甲醇小，對腐殖質(zhì)等有機物雜質(zhì)的溶解性小[23]，可以減少土壤中有機質(zhì)等雜質(zhì)的干擾。且丙酮洗脫液濃縮所用的時間要明顯少于前者，故選擇丙酮(含20% 0.01 mol/L草酸甲醇)作為洗脫液。

圖4 不同洗脫液的效果比較Fig.4 Recoveries of two styles of eluant[注(Note): 洗脫液1為0.01 mol/L草酸甲醇 Eluant 1 was 0.01 mol/L dicarboxyl in methanol; 洗脫液2 為丙酮(含20% 0.01 mol/L草酸甲醇) Eluant 2 was acetone (containing 20% of 0.01 mol/L dicarboxyl in methanol.)]

2.1.3 線性回歸分析、 回收率以及檢出限 配制系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得3種TCs的響應(yīng)面積(y)與濃度(x)均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(R2﹥0.999)，分別以3倍和10倍信噪比求得檢出限和定量限，結(jié)果見表1。將0.5 mg/L和2.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別連續(xù)進樣6次，3種TCs的保留時間和峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在0.6%以下，重現(xiàn)性較好。

表1 3種TCs的線性回歸分析、 檢出限、 定量限和回收率

注(Note)： 土壤、 豬糞和雞糞中OTC、 TC和CTC的加標(biāo)濃度分別為10、 10和20 mg/L The spiking levels of OTC, TC and CTC in soil, swine manure and chicken manure are 10, 10 and 20 mg/L, respectively. LOD—Limit of Detection; LOQ—Limit of quantification.

2.2 土壤和有機肥樣品的測定結(jié)果

利用上述優(yōu)化后的分析方法，對天津市蔬菜種植基地的25個土壤樣品及其附近9個規(guī)模化養(yǎng)豬(雞)場的糞樣和4種商品有機肥進行了檢測。

表2 畜禽糞便和商品有機肥中TCs的殘留情況

注(Note)： nd—未檢出 Not detectable

在檢測的4個商品有機肥樣品中，有2個同時檢測到3種TCs，2個檢測到2種，OTC和CTC的檢出率為100%，TC的檢出率也在50%。OTC、 TC和CTC平均殘留分別為2.6、 0.3和7.7 mg/kg，CTC的平均水平高于集約化養(yǎng)殖場的畜禽糞便中檢測的中間值。

2.2.2 土壤調(diào)查結(jié)果 土壤調(diào)查結(jié)果見表3。從表3可以看出，3個很少施用有機肥的糧田土壤樣品均未檢測到抗生素的殘留。22個菜田土壤樣品中，有14個樣品中檢測到了不同程度的抗生素污染，檢出率為64%。有6個樣品TCs的總量超過歐盟規(guī)定的土壤抗生素殘留的生態(tài)安全觸發(fā)線(100 μg/kg)[26]。TC在8個菜地土壤中檢出，最高殘留量為196.7 μg/kg(風(fēng)干基，以下土壤樣品均為風(fēng)干基); CTC在7個菜地土壤中檢出，最高達(dá)到477.8 μg/kg; OTC在4個菜地土壤中檢出，最高達(dá)到105.6 μg/kg。菜田土壤中3種抗生素的檢出率大小順序為TC(36%)>CTC(32%)>OTC(18%)。

從三種蔬菜栽培方式看，10個溫室土壤樣品有6個檢測到TCs，檢出率為60%; 6個大棚土壤樣品中有4個檢測到TCs，檢出率為67%; 6個露地菜田土壤樣品有5個檢測到TCs，檢出率為83%。TCs總量超過生態(tài)安全觸發(fā)線的6個樣品中有5個出自溫室和大棚土壤，1個來自于露地土壤。

表3還顯示， 菜地中的抗生素殘留呈現(xiàn)一定的地域性，西青區(qū)辛口鎮(zhèn)的7個樣品中均檢出TCs，而在其它幾個鎮(zhèn)的檢出率就很低。但由于對具體施肥數(shù)量和來源調(diào)查不全，尚不能明確施肥數(shù)量和來源對土壤殘留水平的影響。

3 討論

3.1 優(yōu)化分析方法的可靠性和實用性

3.2天津地區(qū)集約化養(yǎng)殖場產(chǎn)生的糞便中TCs殘留狀況

商品有機肥中的有機物料按照標(biāo)準(zhǔn)要求需經(jīng)過嚴(yán)格、 充分的高溫堆腐過程。高溫堆肥可以有效去除畜禽糞便中的TCs，去除效率由大到小的順序均為TC>CTC>OTC[30]。在天津調(diào)查的4個以集約化養(yǎng)殖場的雞糞和豬糞為原料生產(chǎn)的商品有機肥樣品中，依然檢測出不同水平的TCs殘留，OTC、 TC和CTC平均殘留量分別為2.6、 0.3和7.7 mg/kg(干基)，OTC和CTC的平均水平高于集約化養(yǎng)殖場的畜禽糞便中檢測的中間值，商品有機肥中的平均含量是TC

3.3 天津菜地土壤中的TCs殘留狀況

從三種蔬菜栽培方式看，TCs總量超過生態(tài)安全觸發(fā)線的6個土壤中有5個出自溫室和大棚，說明有機肥帶入土壤中的TCs在環(huán)境中的降解和遷移是十分活躍的。雖然TCs一般被視為持久性有機污染物，可能會在土壤中持久存在，并隨時間的延長而不斷的累積[41]，但不同種植年限土壤中的TCs含量主要取決于當(dāng)年或當(dāng)季所使用糞肥中的殘留狀況。隨著施用時間的延長，TCs會逐漸降解，或通過地表徑流、 滲透、 揮發(fā)等過程遷移出地表土壤。露地栽培方式的土壤中TCs相對于溫室和大棚栽培較高的檢出率和較低的殘留水平有可能是因為TCs在露地土壤中的遷移和降解稍遜而導(dǎo)致的長期積累。雞糞和豬糞中殘留的TCs的降解途徑主要為化學(xué)水解，在TCs不穩(wěn)定的A環(huán)手性原子C4和C環(huán)C6的羥基易發(fā)生差向異構(gòu)和降解反應(yīng)[42]。雖然有培養(yǎng)試驗證明在雞糞和豬糞培養(yǎng)前50 d左右，光照對OTC的降解率占了20%[31]，但在實際生產(chǎn)中，光照很難穿透5 cm以下的土層，因此，光降解不是主要途徑。有機肥中可溶性成分可隨水移動，因此，極性強的TCs在露地土壤上更容易在表土層內(nèi)積累。不同栽培方式下，微生物在施肥初期由于抗生素抑制作用，對抗生素的分解貢獻率很小，但隨著時間的延長，微生物對抗生素的分解作用逐步加強。土壤中微生物活性越強，抗生素降解速度越快[38]。溫室和大棚栽培條件下，全年溫室內(nèi)土壤溫度較高，微生物的活性較高，對有機物的分解較快，吸附在有機質(zhì)上的TCs被釋放出來，進而被水解。而北方露地栽培在冬季、 早春土壤溫度一般低于0℃，微生物的活性在此時很低，對有機質(zhì)的分解能力因此減弱，TCs有可能得以吸附于有機質(zhì)上而免于被水解或淋洗。而且溫室、 大棚等設(shè)施菜地土壤的濕度一般比露地菜田的大，高溫、 高濕條件下更有利與抗生素的降解[43]，因此，雖然露地栽培方式的有機肥用量一般低于溫室和大棚，其TCs的檢出率仍有可能高于溫室栽培。

本項調(diào)查中菜田土壤中抗生素的殘留沒有隨種菜年限的延長而增加，種菜時間較短的土壤上TCs的殘留比種菜歷史較長的地塊嚴(yán)重。這可能與種植歷史較長的土壤上產(chǎn)生了對TCs抗性較強的微生物有關(guān)[44-45]。此外，我國動物養(yǎng)殖過程中抗生素使用種類、 數(shù)量也由于管理水平和養(yǎng)殖規(guī)模存在隨機性，天津的雞糞和豬糞樣品殘留的抗生素沒有顯示出一定的規(guī)律性，因此，使用該有機肥的土壤中殘留的TCs種類也沒有顯示出與不同來源有機肥樣品的一致性。由于此項調(diào)查的土壤均來自隨機選取的農(nóng)田，有機肥來源、 有機肥質(zhì)量以及種植作物個體性強，除了大體上看出抗生素的殘留狀況，尚不能得出施肥量、 有機肥種類以及施用時間與TCs殘留之間的關(guān)系。因此，從源頭上控制進入土壤的TCs總量才是防治TCs殘留的最好方法。

3.4 有機肥的施用風(fēng)險

目前，雖然已有一些關(guān)于TCs在畜禽糞和在土壤中降解特征的研究，但是有機肥-土壤-植物體系中抗生素的研究還不夠系統(tǒng)，比如，由有機肥帶入的抗生素與土壤中抗生素殘留之間的關(guān)系; 不同抗生素殘留水平下作物對抗生素的吸收情況; 畜禽糞肥施入土壤后給人類帶來的健康風(fēng)險以及有機肥的安全用量等方面還有待研究。

4 結(jié)論

2)天津集約化養(yǎng)殖場的畜禽糞中CTC檢出率達(dá)到78%，中間值為6.4 mg/kg，最高值達(dá)到563.8 mg/kg; OTC和TC的檢出率也高達(dá)56%，中間值分別為7.3和1.5 mg/kg，最高值達(dá)到34.8和22.7 mg/kg。

3)商品有機肥中同樣存在TCs殘留，且三種抗生素的殘留水平和檢出率與養(yǎng)殖場相當(dāng)，商品有機肥的生態(tài)安全仍然是需要關(guān)注的。

4)天津土壤樣品中TCs的總檢出率為64%。三種抗生素中，OTC檢出率最低(18%)，最高值達(dá)到105.6 μg/kg(風(fēng)干基)，平均9.4 μg/kg; TC檢出率為36%，最高值達(dá)到196.7 μg/kg，平均28.9 μg/kg; CTC檢出率為32%，最高值達(dá)到477.8 μg/kg，平均48.9 μg/kg。有6個菜田土壤樣品(占調(diào)查樣品的27.3%)TCs總量超過生態(tài)安全觸發(fā)線，存在一定的生態(tài)風(fēng)險。

5)天津菜田土壤中的TCs的殘留主要由畜禽肥帶來。本調(diào)查土壤中抗生素殘留未隨種菜年限延長而增加，溫室和大棚土壤的TCs殘留水平高于露地土壤。

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OptimizationofresidualtetracyclinesanalysisinsoilsandmanureusingSPE-HPLCandpilotsurveyinTianjin

ZHANG Zhi-qiang1, LI Chun-hua1, HUANG Shao-wen1*, GAO Wei2, TANG Ji-wei1

(1InstituteofAgriculturalResourcesandRegionalPlanning,ChineseAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofPlantNutritionandFertilizer,MinistryofAgriculture,Beijing100081,China;2TianjinInstituteofAgriculturalResourcesandEnvironment,Tianjin300192,China)

X53; S129

A

1008-505X(2013)03-0713-14

2012-10-17接受日期2013-02-03

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-25-C-11); 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203095); 國家留學(xué)基金(2012-01)資助。

張志強(1985—)，男，山東壽光人，碩士研究生，主要從事肥料資源利用研究。E-mail:zzq551@qq.com *通信作者 Tel: 010-82108662, E-mail: huangshaowen@caas.cn