反相高效液相法測定復(fù)方膽通膠囊中大黃酚及大黃素含量

楊 艷

復(fù)方膽通膠囊中含有茵陳、穿心蓮、溪黃草、膽通、大黃等多種中草藥成分，具有清熱利膽、解痙止痛之功效，主要用于膽管炎、急/慢性膽囊炎、膽囊術(shù)后綜合征、膽道功能性疾病、膽囊及膽道結(jié)石合并感染等［1］。大黃是復(fù)方膽通膠囊的主要成分，但由于大黃分子復(fù)雜，通常以大黃素和大黃酚含量作為大黃生藥的質(zhì)量監(jiān)控指標(biāo)。目前多用常規(guī)色譜柱分析大黃酚及大黃素含量，但其分離度低，所需流動相多，且成本較高。本文參照《中國藥典》2010年版一部及相關(guān)文獻(xiàn)項(xiàng)下方法［2-6］，建立反相高效液相細(xì)孔柱法同時(shí)測定復(fù)方膽通膠囊中大黃酚及大黃素的含量，為檢測膽通膠囊的內(nèi)在質(zhì)量提供了標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)。

1 儀器與試藥

Dionex高效液相色譜儀(包括UltiMate 3000 Series Pump Systems泵系統(tǒng)、Dionex ASI-100自動進(jìn)樣器、TSP Spectra 100檢測器、Chromeleon數(shù)據(jù)軟件分析系統(tǒng)、Julabo ED柱溫箱);Hypersil ODS(Thermo，德國);METTLER電子天平(感量:0.01 mg，瑞士Mettler Toledo公司);KQ-50B型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

大黃素(批號:1202156-2012221，含量測定)、大黃酚(批號:119566-2012116，含量測定)由中國藥品生物制品檢定所提供;乙腈為色譜純(Merck，德國);水為超純水(Milli-Q，美國);其他試劑均為分析純。復(fù)方膽通膠囊購自通化金馬藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號:Z20054329，成分為膽通100 g、溪黃草900 g、茵陳600 g、穿心蓮300 g、大黃30 g，每粒裝0.42 g(含羥甲香豆素100 mg)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil ODS反相細(xì)孔柱(2.1 mm × 250 mm，5 μm)，流動相為乙腈∶0.1%磷酸 =85∶15，流速為 0.4 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的配制 分別取大黃素、大黃酚對照品0.50 g，精密稱定，用乙腈溶解，配制成濃度分別為454、671 μg/mL的對照品儲備液。取對照品儲備液適量，稀釋為大黃素、大黃酚濃度分別為2.09、4.00 μg/mL 的對照品溶液。

2.2.2 供試樣品的制備 稱取約0.50 g待測樣品，置于陶瓷硏缽中，研磨，取約0.30 g，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至100 mL，用0.45 μm有機(jī)系濾頭過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL置10 mL量瓶中，用甲醇定容。將混合液轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，減壓蒸餾除去溶劑，加8%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸溶液10 mL，并超聲水浴處理2 min，再加氯仿10 mL，加熱回流1 h，放置至室溫并轉(zhuǎn)移至50 mL分液漏斗中;用少量氯仿洗滌容器并轉(zhuǎn)入分液漏斗中，劇烈震搖待靜分層后取氯仿層，用氯仿萃取3次，每次10 mL，合并氯仿層，減壓蒸發(fā)溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，移?0 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻并用0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 除去大黃，按處方比例制成陰性對照樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取對照品和供試樣品各1 mL，分置50 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10 μL，結(jié)果理論塔板數(shù)大黃酚及大黃素計(jì)算不小于1 500;大黃酚及大黃素峰分離度大于2.0，對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣主峰面積的RSD＜2.0%(n=5)。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取大黃酚及大黃素對照品各 1、2、5、10、20、40 μL，分別注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積的自然對數(shù)值為縱坐標(biāo)、大黃酚及大黃素進(jìn)樣量的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y(大黃酚)=1.223 8 X+2.673 8，r=0.999 9;Y(大黃素)=1.013 6 X+1.392 8，r=0.999 7。結(jié)果表明，膽通膠囊中大黃酚含量測定在0.01～0.15 μg/g范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，大黃素含量測定在0.02～0.24 μg/g范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果表明，大黃酚及大黃素含量的RSD值分別為1.26%和0.98%(n=6)。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號為071204的樣品6份，各0.5 g，照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以大黃酚及大黃素的峰面積計(jì)算，RSD=0.98%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于2、8、16、24、48 h 注入液相色譜儀各 10 μL，以大黃酚及大黃素的峰面積計(jì)算，RSD=0.96%。表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.8 樣品含量測定 分別取批號為091324、071204、096253的樣品，照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以大黃酚及大黃素的峰面積計(jì)算。結(jié)果見表1。

2.9 回收率試驗(yàn) 溶液制備同“2.2.2”項(xiàng)下方法，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中大黃素、大黃酚的含量，根據(jù)含量結(jié)果計(jì)算回收率，5種濃度大黃素的平均回收率(n=15)為99.5%(RSD=0.8%)，5種濃度大黃酚平均回收率(n=15)為99.3%(RSD=0.8%)。說明此方法得到的測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。見表2。

表1 樣品含量測定結(jié)果(μg/g)

表2 回收率實(shí)驗(yàn)測定大黃素及大黃酚結(jié)果

3 討論

筆者對復(fù)方膽通膠囊中大黃素和大黃酚的分離條件進(jìn)行考察，參考了《中國藥典》2010年版一部及相關(guān)文獻(xiàn)的方法［2-6］，并首創(chuàng)性地運(yùn)用內(nèi)徑2.1 mm的反向ODS細(xì)孔柱對復(fù)方膽通膠囊中大黃素和大黃酚的含量進(jìn)行了檢測。由于細(xì)孔柱內(nèi)徑小，柱體積小，柱壓大，因此，選擇流速0.4 mL/min對樣品洗脫。所需流動相僅為常規(guī)反向柱的2/5，分離度好，線性范圍廣，重現(xiàn)性高，為提高復(fù)方膽通膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)和參考。

［1］鄭玉梅，劉鵬.HPLC法測定逐瘀通脈膠囊中大黃素的含量［J］.心理醫(yī)生雜志，2011，5:10-11.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:22，903.

［3］李志梅.HPLC法測定致康膠囊中大黃酸、大黃素和大黃酚的含量［J］.海峽藥學(xué)雜志，2010，22(7):102-103.

［4］薛小平，鹿燕敏，王倩，等.HPLC法測定清熱解毒方蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15(7):6-8.

［5］賀凡珍，蔡學(xué)瑩，彭維，等.HPLC法同時(shí)測定大黃中5種蒽醌的含量［J］.中藥材雜志，2011，34(9):1834-1835.

［6］陳長水，桑旭峰.HPLC法測定八正合劑中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，(5):1088-1089.