黃芪對喉癌細胞增殖和凋亡的影響

宋 巖，劉秀萍，白偉良，季文樾

隨著分子生物學、細胞生物學、腫瘤學等相關(guān)生命學科的迅猛發(fā)展，喉癌的化療藥物研究也進入了一個新階段［1］。近年來國內(nèi)外研究表明，清熱類中藥黃芪可通過調(diào)節(jié)花生四烯酸系統(tǒng)的代謝，誘導腫瘤細胞周期停滯及細胞凋亡，抑制腫瘤新生血管生成，抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性等發(fā)揮其抗腫瘤作用［2］。文獻報道其在膀胱癌、胃癌治療方面作用顯著，但在喉癌治療中的研究甚少，本文就黃芪對喉癌細胞增殖和凋亡的影響進行了研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 細胞株:喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞株購自中國科學院細胞庫。試劑:黃芪注射液購自正大青春寶集團;Annexin V凋亡檢測試劑盒購自凱基公司;MTT、碘化丙啶(Proidum iodide，PI)、二甲基亞楓(DimethyI sulfoxide，DMSO)等購自北京鼎國生物公司;TMPI-1640培養(yǎng)液購于美國Gibco公司;RnaseA購于碧云天;標準胎牛血清購自杭州四季青公司;青鏈霉素、磷酸鹽緩沖溶液(Phophate buffered saline，PBS)購自上海生工生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞用含10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，加100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)，48 h傳一代，取對數(shù)生長期用于實驗。

1.2.2 MTT比色法檢測細胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期Hep-2細胞，常規(guī)胰酶消化，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×105個/L，接種于96孔板，貼壁24 h后，換成含有不同濃度黃芪(20、100、200 μg/mL)的培養(yǎng)液，每組3個復孔，作用24 h后，加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶標試儀測定490 nm處吸光度(A)值繪制生長曲線，觀察藥物抑制細胞生長情況。細胞增殖抑制率=(1-加藥孔細胞A值/對照孔細胞A值)×100%。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 將適當濃度的對數(shù)生長期Hep-2細胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)基，加入含有不同濃度黃芪(20、100、200 μg/mL)的培養(yǎng)液，分別作用24 h，收集 1×106個細胞，1 000 r/min離心10 min，PBS洗1次，4℃、75%冰乙醇固定24 h，PBS洗3次，上機前加入PI冰浴避光放置1 h，調(diào)整細胞濃度到1×106個/L，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率，如此重復3次。

1.2.4 細胞形態(tài)學觀察 取對數(shù)生長期細胞，每瓶4×105接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后，按“1.2.3”項方法分組處理各組細胞，繼續(xù)孵育培養(yǎng)24 h后，應用光學倒置顯微鏡觀察細胞生長形態(tài)，并隨機拍照。

1.2.5 Hoechst 33258染色觀察細胞核形態(tài)變化將預處理過的蓋玻片置于6孔板內(nèi)，Hep-2細胞密度調(diào)整為5×105/mL，各取1 mL種入6孔板培養(yǎng)過夜，使細胞長至60%～80%。給藥組加入200 μg/mL的黃芪培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，吸盡培養(yǎng)液，加入固定液0.5 mL固定15 min，PBS洗2次，加1 mL Hoechst 33258熒光染液，避光10 min，封片后熒光顯微鏡觀察，照相，見圖1。

圖1 Hoechst 33258熒光染色法觀察黃芪作用前后細胞形態(tài)學變化

1.3 統(tǒng)計學分析 采用Excel統(tǒng)計數(shù)據(jù)，SPSS 12.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用表示，兩組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測黃芪對Hep-2細胞生長的抑制作用 通過繪制細胞生長曲線發(fā)現(xiàn)，黃芪可抑制Hep-2細胞生長，并且隨著藥物濃度增加其生長抑制率也增加，兩者存在濃度相關(guān)性。見表1。

表1 不同濃度黃芪作用24 h后抑制率、凋亡率比較(%)

2.2 黃芪對喉癌Hep-2細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，黃芪具有誘導喉癌Hep-2細胞凋亡的作用，細胞凋亡發(fā)生率隨黃芪濃度增加而明顯增加。結(jié)果見表2。

表2 不同濃度黃芪作用24 h后細胞各周期分布(%)

2.3 光鏡觀察 由倒置相差顯微鏡可以觀察到，與未經(jīng)處理的對照組相比，干預組都有不同程度的形態(tài)改變，見圖2。

2.4 Hoechst 33258染色熒光顯微鏡觀察 200 μg/mL黃芪作用于Hep-2細胞24 h后，細胞發(fā)生顯著性形態(tài)學改變，出現(xiàn)大量染色質(zhì)邊聚，細胞核固縮，甚至可見核碎裂、核溶解特征性表現(xiàn)。凋亡的細胞隨著黃芪濃度的增加明顯增多，最后大片細胞脫落，可觀察到細胞脫失區(qū)，結(jié)果見圖2。

圖2 光鏡下觀察黃芪作用前后Hep-2細胞形態(tài)學變化

3 討論

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，在中國東北發(fā)病率較高，近年來發(fā)病率在世界范圍內(nèi)也呈上升趨勢。目前，在放化療和外科手術(shù)聯(lián)合治療的情況下，Tis、T1及T2期喉癌治療有效率為80%～90%，而T3、T4期喉癌只有40%～50%。盡管外科手術(shù)和放化療技術(shù)有了明顯進步，但患者的5年生存率仍沒有提高，原因是多方面的，其中對發(fā)病機制研究不夠完善、沒有明確的治療靶點是最關(guān)鍵的原因。

本研究表明，黃芪具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用。MTT檢測結(jié)果表明，黃芪可抑制Hep-2細胞，且隨著藥物濃度增加其生長抑制率也增加，兩者存在濃度依賴關(guān)系。濃度為20、100、200 μg/mL時，抑瘤率分別為35.38% ±0.17%、59.12% ±0.21%、84.55% ±0.27%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。抑制率隨濃度增加而逐漸上升，到 200 μg/mL時，其抑制率達84.55% ±0.27%，抑瘤作用顯著，由此推斷黃芪可以在體內(nèi)外發(fā)揮對喉癌的抑制作用。筆者用流式細胞儀檢測不同濃度黃芪作用Hep-2細胞后引起的細胞凋亡率的變化，發(fā)現(xiàn)20 μg/mL時凋亡率為38.2% ±1.3%，100 μg/mL時凋亡率為 87.2% ±1.7%，200 μg/mL濃度時凋亡率為94.6% ±1.3%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，說明黃芪可有效促進喉癌Hep-2細胞凋亡。

筆者采用光鏡與免疫熒光染色對給藥前后喉癌Hep-2細胞進行微觀對比，發(fā)現(xiàn)光鏡下黃芪作用細胞24 h后，隨著黃芪濃度的增加，細胞變圓，不規(guī)則，細胞數(shù)目明顯減少，細胞間隙變大;熒光染色下，細胞出現(xiàn)核碎裂，核仁消失，染色質(zhì)固縮，可見凋亡細胞，嚴重時成片細胞脫落。對照組喉癌Hep-2細胞生長良好，細胞形態(tài)圓，胞膜表面光滑，無凋亡發(fā)生。

黃芪為多年生草本植物，主要成分為黃酮，如黃芪素。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪素可下調(diào)bcl-2表達，上調(diào)Bax表達，通過細胞色素C-線粒體-Caspase-3途徑誘導乳腺癌細胞凋亡［3］。Roy等［4］發(fā)現(xiàn)，小劑量黃芪素(10或20 mol/L)使人白血病HL-60細胞大量停滯于S或G2/M期，而大劑量黃芪素則誘導細胞凋亡。黃芪具有誘導多種腫瘤細胞凋亡、影響細胞周期、抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等特點，但其抗腫瘤機制復雜多樣，尚未完全明確［5］。筆者用不同濃度的黃芪進行體外抑癌實驗，應用不同方式檢測不同濃度黃芪對喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞的促凋亡作用，發(fā)現(xiàn)黃芪體外作用人喉癌Hep-2細胞后，可抑制腫瘤細胞生長，促進其凋亡以達到抗癌作用，但具體機制有待進一步研究。

［1］Tsai YS，Lee KW，Huang JL，et al.Arecoline，a major alkaloid of areca nut，inhibits p53，represses DNA repair，and triggers DNA damage response in human epithelial cells［J］.Toxicology，2008，249(2-3):230-237.

［2］毛捷，徐善水，盛莉莉，等.黃芪素的抗腫瘤作用及機制的研究進展［J］.中國臨床藥理學與治療學，2009，14(10):1178-1182.

［3］Lee JH，Li YC，Ip SW，et al.The role of Ca2+in baicalein induced apoptosis in human breast MDA-MB-231 cancer cells through mitochondria and caspase-3-dependent pathway［J］.Anticancer Res，2007，27(1A):117-125.

［4］Roy MK，Nakahara K，Na TV，et al.Baicalein，a flavonoid extracted from a methanolic extract of Oroxylum indicum inhibits proliferation of a cancer cell line in vitro via induction of apoptosis［J］.Pharmazie，2007，62(2):149-153.

［5］王曉瑜，龍漢安.黃芪及黃酮類成分防治腫瘤作用的研究進展［J］.華西醫(yī)學，2011，26(2):297-300.