野生型和轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)TNT的研究進展

連桂云，劉均洪

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島266042）

大規(guī)模生產(chǎn)和加工彈藥產(chǎn)生的化合物已經(jīng)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，這些化合物在軍事射擊場、戰(zhàn)區(qū)、炸藥生產(chǎn)地區(qū)均可以發(fā)現(xiàn)[1］，如 TNT（2，4，6－三硝基甲苯）、RDX（1，3，5－三硝基－1，3，5－三氮雜環(huán)己烷，又稱環(huán)三亞甲基三硝胺、黑索今）和 HMX（1，3，5，7－四硝基－1，3，5，7－四氮雜環(huán)辛烷，又稱環(huán)四亞甲基四硝胺、奧克托今）[2］。土壤中濃度最高的是TNT，達到4000～10 000mg·kg－1，極端情況下甚至達到87 000mg·kg－1[3，4］。TNT 及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物都是有毒的，蚯蚓急性毒性試驗表明，其半致死量為143mg·kg－1[5］。TNT被美國環(huán)境保護局確認(rèn)為潛在的致癌物（C類），直接接觸，可導(dǎo)致貧血、肝功能紊亂、皮膚刺激或免疫系統(tǒng)的損害[1］。227.13，logKOW（辛醇－水分配系數(shù)）為0.87，水溶性為0.15%，難于降解，會在環(huán)境中持久存在，對生物產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，對TNT污染土壤和污染水進行修復(fù)十分重要。目前的修復(fù)方法主要為焚燒、吸附、化學(xué)氧化法，不僅耗時、成本高，而且焚燒法因NOx的排放會造成額外的環(huán)境問題，化學(xué)氧化法也可能會產(chǎn)生有毒的副產(chǎn)物，因此，其應(yīng)用受到限制。生物法利用具有潛在修復(fù)能力的微生物和植物來清潔環(huán)境，是近年來新興的修復(fù)方法。一些細(xì)菌可以利用TNT作為氮源，從而產(chǎn)生修復(fù)能力，但可能會因為其它有毒的底物失去活性[6］。植物修復(fù)是一種利用綠色植物修復(fù)TNT土壤污染和水污染的方法，成本低、適應(yīng)性強，并且其耐受TNT的能力要比微生物強。因此，植物修復(fù)TNT土壤污染和水污染的效果更好。

作者在此對植物修復(fù)TNT水污染和土壤污染的最新成果進行綜述。

1 植物修復(fù)TNT的優(yōu)缺點

植物修復(fù)有很多優(yōu)點，如地區(qū)適應(yīng)性強、成本低、不需要具體的設(shè)備、不會再引入新的污染物質(zhì)、容易被社會接受等。它適用于logKOW＝0.3～3之間的化合物，這些化合物可以進入根內(nèi)皮層，利于植物吸收。植物修復(fù)效率取決于pH值、pKa（電離常數(shù)）、有機物含量、植物生理特性、土壤環(huán)境－濕度和土壤組成等因素。植物修復(fù)也存在缺點：當(dāng)污染地區(qū)TNT濃度過高時，會對植物產(chǎn)生毒性從而抑制植物的修復(fù)作用[7］；修復(fù)時間長，并且修復(fù)作用只能發(fā)生在植物的根部。

2 利用野生型植物修復(fù)TNT

目前，大多數(shù)研究分析了植物對水中TNT的修復(fù)情況，發(fā)現(xiàn)植物可以在很短的時間內(nèi)吸收水中大多數(shù)的TNT，而對土壤中TNT的植物修復(fù)情況研究報道較少。

Best等[8］研究發(fā)現(xiàn)，在地下水中，當(dāng)TNT初始濃度為681μg·L－1（0.003mmol·L－1）時，10d內(nèi)可以被10種水生植物降解94%～100%。研究表明，當(dāng)水中TNT初始濃度為0.11mmol·L－1時，Myriophyllum aquaticum 可以在15d內(nèi)降解全部的TNT[9］。Hughes等[10］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水中 TNT 初始濃度為0.44mmol·L－1時，Myriophyllum aquaticum可以在5d內(nèi)降解全部的TNT；Myriophyllum spicatum在7d內(nèi)可以完全轉(zhuǎn)化初始濃度為0.35 mmol·L－1的TNT，植物吸收量為1.6mg·g－1，植物密度為50gl·L－1，明顯高于Pavlostathis等[11］測得的植物吸收量 （0.29mg·g－1）。Catharanthus roseus是另一種可以在介質(zhì)中除去TNT的植物，當(dāng)TNT初始濃度為0.44mmol·L－1時，它可以在5d內(nèi)降解全部的 TNT[10］。

上述水生植物在實驗室條件下可以很好地發(fā)揮作用，但是由于地區(qū)差異，它們在其它地區(qū)可能不能很好地生長。此時，就可以利用沼生植物來修復(fù)TNT。Nepovim等[12］研究發(fā)現(xiàn)，常見的蘆葦（Phragmites australis）、綠色燈芯草（Juncus glaucus）、莎草（Carem gracillis）和香蒲（Typha latifolia）可以在10d內(nèi)從液體介質(zhì)中降解接近90%的TNT（初始濃度為0.44mmol·L－1），其中效果最好的是蘆葦，它還可以降解污染土壤中98%的TNT。Best等[13］研究發(fā)現(xiàn)，菖蒲（Acorus calamus）、草蘆（Phalaris arundinacea）和蒯草 （Scirpus cyperinus）可以在7d內(nèi)從地下水中吸收90%的TNT。

研究人員還研究了在水環(huán)境中陸生植物吸附TNT的能力。Adamia等[1］研究了8種植物吸收TNT的能力，發(fā)現(xiàn)大豆（Glycine max）吸收TNT的能力最強，吸收量為0.21mg·g－1；鷹嘴豆（Cicer arietinum）和毒麥（Lolium multiflorum）的吸收能力較弱。毒麥可以在72h內(nèi)將初始濃度為100μmol·L－1的 TNT 降解94.3%。

Makris等[14］研 究 發(fā) 現(xiàn)，香 根 草 （Vetiveria zizanioides）可以在8d內(nèi)將水溶液中初始濃度為0.18 mmol·L－1的TNT全部吸收，植物吸收量為1.03mg·g－1；如果在溶液中加入離液劑（含尿素和硫脲），可以破壞水的結(jié)構(gòu)，增加疏水性化合物TNT的溶解性，從而促進植物對TNT的吸收。實驗證明，當(dāng)加入離液劑時，在30min內(nèi)TNT可以降解25%；而不加離液劑時，在相同的時間內(nèi)TNT只降解10%。

香根草消除土壤中TNT也是非常有效的。Das等[15］研究發(fā)現(xiàn)，在土壤中TNT初始濃度為40mg·kg－1時，香根草可以在3d內(nèi)降解97%的TNT；當(dāng)TNT初始濃度為80mg·kg－1時，3d內(nèi)降解39%的TNT，12d內(nèi)降解88%的TNT。在土壤中加入離液劑（0.1%）會促進植物對TNT的吸收，當(dāng)TNT濃度較高時，這種作用更明顯。

Chang等[16］研究了青麻（Abutillon avicennae）對土壤中TNT的修復(fù)。當(dāng)土壤中TNT的初始濃度為120mg·kg－1時，50d后，含青麻土壤中TNT的剩余含量為23.2%，而不含青麻土壤中TNT的剩余含量為48.1%。

植物對TNT的修復(fù)研究成果見表1 。

以上研究表明，植物可以吸收環(huán)境中的TNT，此外，植物提取物中TNT的缺失表明植物有能力轉(zhuǎn)化TNT。大多數(shù)的轉(zhuǎn)化發(fā)生在植物的根部，這可以用14C和放射自顯影術(shù)進行分析[1］。已有很多研究報道，植物降解TNT的第一步產(chǎn)物為4－氨基－2，6－二硝基甲苯（4A26DNT）和2－氨基－4，6－二硝基甲苯（2A46DNT），此外，還檢測到很多不明的極性產(chǎn)物[12］；接下來的轉(zhuǎn)化是非生物氧化和氧化偶氮產(chǎn)物的形成；最后一步轉(zhuǎn)化產(chǎn)物大多為單糖或者二糖的共軛產(chǎn)物，它們可以存在于植物的細(xì)胞液或細(xì)胞壁中[4］。TNT在植物中的轉(zhuǎn)化涉及多種酶，包括硝基還原酶[17］、過氧化物酶、酚氧化酶、葡基轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶，這些酶在糖和谷胱甘肽結(jié)合形成氨基衍生物的過程中起著非常重要的作用。

3 利用轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)TNT

植物修復(fù)被認(rèn)為是清潔環(huán)境中污染物的有效方法。但是，植物是自養(yǎng)生物，沒有有效代謝有機物的酶機制，這就導(dǎo)致植物修復(fù)過程緩慢并且不徹底。在過去的幾年內(nèi)，很多研究致力于將植物進行遺傳改造，如通過細(xì)菌轉(zhuǎn)化法，在植物中引入可以編碼代謝TNT的酶（如硝基還原酶、細(xì)胞色素P450）的基因，以提高植物吸收和代謝TNT的能力。因此，轉(zhuǎn)基因植物吸收TNT的能力比野生型植物更強[18］。

第一個用于降解TNT的轉(zhuǎn)基因植物是煙草（Nicotiana tabacum），在其中引入了季戊四醇四硝酸酯（PETN）還原酶（從Enterobacter cloacae中分離，Enterobacter cloacae最初來源于含炸藥污染物的土壤中），它是硝基還原酶的一種，可以降解硝基酯和含硝基的炸藥化合物。轉(zhuǎn)基因煙草在TNT濃度為0.05mmol·L－1時能夠發(fā)芽生長，而這個濃度足以抑制野生型煙草的生長。有很多其它類型的硝基還原酶可以催化TNT上的硝基成為羥氨基和氨基衍生物。Hannink等[19］進行了轉(zhuǎn)基因煙草表達NfsI硝基還原酶（從Enterobacter cloacae中分離）的相關(guān)研究。72h內(nèi)，轉(zhuǎn)基因煙草可以完全吸收水溶液中初始濃度為0.25mmol·L－1的TNT，而野生型煙草吸收TNT的能力卻不明顯；轉(zhuǎn)基因煙草可以耐受高濃度的TNT（0.5mmol·L－1），而0.5mmol·L－1的 TNT會導(dǎo)致野生型煙草死亡。Hannink等[20］還發(fā)現(xiàn)，TNT轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（4－氨基－2，6－二硝基甲苯）與轉(zhuǎn)基因煙草的大分子結(jié)合能力要比與野生型煙草的結(jié)合能力更強。Travis等[21］研究表明，含硝基還原酶的轉(zhuǎn)基因植物在土壤中對TNT的耐受能力要比野生型的強。有報道稱，在應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物的區(qū)域，當(dāng)TNT濃度高時，植株根部的細(xì)菌數(shù)量和細(xì)菌群落的遺傳多樣性都有提高。

表1 植物對TNT的修復(fù)研究成果Tab.1 Research of phytoremediation of TNT by plants

Strand等[22］比較了轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草對TNT的吸收能力，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草耐受TNT的能力明顯高于野生型煙草；當(dāng)土壤中TNT濃度大于500 mg·kg－1時，兩種煙草都會發(fā)育遲緩，導(dǎo)致萎黃??；但含硝基還原酶的轉(zhuǎn)基因煙草的嚴(yán)重程度要低于野生型煙草。當(dāng)引入NfsI硝基還原酶（從Escherichia coli中分離）到擬南芥 （Arabidopsis thaliana）中時，轉(zhuǎn)基因植株吸收TNT的量是野生型的7～8倍。當(dāng)TNT濃度達到250mg·kg－1時，轉(zhuǎn)基因擬南芥仍可以生長，而野生型擬南芥在TNT濃度為50mg·kg－1時生長就會受到影響。

另一種轉(zhuǎn)基因植物白楊（Populus tremula xtremuloides var.Etropole）表達了細(xì)菌中硝基還原酶基因pnrA，它可以比野生型白楊耐受和吸收更高濃度的TNT。在水中，轉(zhuǎn)基因白楊可以在TNT濃度為57 mg·L－1時生長，而野生型白楊在TNT濃度為11mg·L－1時生長就會受到明顯影響。在受污染的土壤中，野生型白楊可以耐受的TNT濃度為500mg·kg－1，而轉(zhuǎn)基因白楊可以耐受的TNT濃度為1000mg·kg－1。為了比較野生型白楊和轉(zhuǎn)基因白楊對TNT的吸 收 能 力，van Dillewijn 等[23］采 用 不 同 濃 度 的TNT進行比較研究。結(jié)果表明，在水中，在TNT濃度較低（20mg·L－1和35mg·L－1）的情況下，兩種白楊吸收TNT的能力相當(dāng)；但是當(dāng)TNT濃度達到50mg·L－1時，含pnrA的轉(zhuǎn)基因白楊降解TNT的速率明顯快于野生型白楊；在土壤中，轉(zhuǎn)基因白楊吸收TNT的能力也要明顯高于野生型白楊。

4 展望

植物具有修復(fù)環(huán)境中污染物的能力，環(huán)境中的TNT可以被很多植物吸收，吸收率一般在70%～100%。大多數(shù)情況下，在植物的根部區(qū)域發(fā)生一系列的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，TNT的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為單糖或者二糖的共軛產(chǎn)物，它們可以存在于植物的細(xì)胞液或細(xì)胞壁中。當(dāng)水或土壤中TNT濃度高時，植物修復(fù)TNT的適用性受到限制。對于很多植物，當(dāng)土壤中TNT濃度達到100～500mg·kg－1時，植物修復(fù)就受到限制。因此，植物修復(fù)方法只適用于環(huán)境中TNT濃度低的情況。

到目前為止，大多數(shù)研究都只是在實驗室中進行，而缺少植物修復(fù)的實際應(yīng)用。此外，很多用來做實驗的植物是農(nóng)業(yè)植物品種，這些植物是不建議用作植物修復(fù)的。因此，仍需繼續(xù)努力尋找具有高TNT吸收能力的植物。

轉(zhuǎn)基因植物可以選擇性地降解污染化合物，且其修復(fù)能力要比野生型植物更強。轉(zhuǎn)基因植物能耐高濃度TNT、吸收更多量的TNT，并將其有效降解，對含高濃度TNT的水或土壤有更強的適應(yīng)性。目前，利用轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)TNT的技術(shù)還處于實驗室階段，溫室和大田實驗還需要進一步研究。

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