應(yīng)用痰模型涂片法檢測抗酸桿菌結(jié)果分析＊

劉慶福，劉予東，嚴(yán)秀麗，邵德成

（1.山東省泰安市結(jié)核病防治中心參比實驗室 271000；2.山東省泰安市泰山區(qū)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治科 271000；3.山東省泰安市寧陽縣結(jié)核病防治所 271000）

痰涂片檢測抗酸桿菌作為發(fā)現(xiàn)傳染源、選擇化療方案、考核評價療效的重要手段，在現(xiàn)代結(jié)核病控制工作中占有不可或缺的位置。就方法學(xué)而言，痰涂片抗酸染色檢測抗酸桿菌并不復(fù)雜，關(guān)鍵是如何提高抗酸桿菌的陽性檢出率，因此，加強痰標(biāo)本采集、染色劑制備、涂片制備、染色、顯微鏡鏡檢、結(jié)果報告等環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，特別是涂片制備是提高制片質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。為了提高制片質(zhì)量和抗酸桿菌陽性檢出率，及時發(fā)現(xiàn)傳染性肺結(jié)核患者，泰安市結(jié)核病防治中心劉慶福［1］帶領(lǐng)的課題組研發(fā)出了痰模型涂片法檢測抗酸桿菌，它通過對照玻片下面的標(biāo)準(zhǔn)膜，在玻片正面均勻涂抹成10mm×20mm橢圓形痰膜，有效控制了痰膜涂抹大小，從而實現(xiàn)了制片標(biāo)準(zhǔn)化，提高了制片質(zhì)量和抗酸桿菌陽性檢出率［1］。寧陽縣結(jié)核病防治所2010年1月至2012年6月初診的活動性肺結(jié)核患者，作為應(yīng)用組應(yīng)用痰模型涂片法檢測抗酸桿菌，現(xiàn)將應(yīng)用組檢測結(jié)果與劉慶福等［1］報道的研究組檢測結(jié)果對比分析如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

1.1.1 應(yīng)用組 收集寧陽縣結(jié)核病防治所2010年1月至2012年6月初診的活動性肺結(jié)核患者，經(jīng)臨床、放射、檢驗醫(yī)生會診，挑選排菌可能性較大的肺結(jié)核患者為檢測對象，如肺空洞、肺實變、支氣管播散等患者共計260例，診斷標(biāo)準(zhǔn)見文獻［2］。其中肺空洞21例，男11例，女10例，年齡17～72歲，平均（37±10.2）歲；肺實變67例，男32例，女35例，年齡19～81歲，平均（50±13.9）歲；支氣管播散172例，男98例，女74例，年齡14～69歲，平均（36±12.7）歲。每位患者按要求留取當(dāng)日即時痰、夜間痰、次日晨痰3份痰標(biāo)本送檢，共計780份，留痰前的健康教育由檢驗人員采用示范法［3］指導(dǎo)患者留痰，即語言加動作給患者示范漱口刷牙、輕咳棄去咽喉部異物、深吸氣猛咳等整個留痰過程。當(dāng)日即時痰為患者就診時深咳出的痰液，次日晨痰為次日晨起后用力深咳出的痰液，夜間痰為當(dāng)日晚至次日晨在夜間深咳出的痰液。

1.1.2 研究組 收集泰安市結(jié)核病防治院、泰安市泰山區(qū)疾病預(yù)防控制中心在2010年1～12月初診的活動性肺結(jié)核患者，經(jīng)臨床、放射、檢驗醫(yī)生會診，挑選排菌可能性較大的肺結(jié)核患者為研究對象，如肺空洞、肺實變、支氣管播散等患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)見文獻［2］。其中肺空洞29例，男16例，女13例，年齡18～70歲，平均（39±11.5）歲；肺實變87例，男48例，女39例，年齡21～87歲，平均（52±14.6）歲；支氣管播散247例，男129例，女118例，年齡16～73歲，平均（36±12.7）歲。每位患者按要求留取當(dāng)日即時痰、夜間痰、次日晨痰3份痰標(biāo)本送檢，共計1 089份。留痰方法同應(yīng)用組。

1.2 實驗方法 應(yīng)用組與研究組實驗方法完全相同。

1.2.1 模型涂片法 涂片時將潔凈的玻片放入旋轉(zhuǎn)式抗酸桿菌涂片標(biāo)準(zhǔn)模型板玻片槽內(nèi)，用折斷的竹簽茬端挑取痰標(biāo)本的膿樣、干酪樣、黏液樣等可疑部分約0.05～0.1mL，對照玻片下面的標(biāo)準(zhǔn)膜，在玻片正面均勻涂抹成10mm×20mm橢圓形痰膜。

1.2.3 染色鏡檢 染色在旋轉(zhuǎn)式抗酸桿菌涂片標(biāo)準(zhǔn)模型板上進行，往痰膜上加石碳酸復(fù)紅溶液，加熱至有蒸氣出現(xiàn)，切不可沸騰，染5min，旋轉(zhuǎn)90°棄去復(fù)紅染液并用水沖洗干凈，加3%的鹽酸乙醇脫色至紅色完全脫去，旋轉(zhuǎn)90°棄去鹽酸乙醇并用水沖洗干凈，加亞甲藍復(fù)染1min，旋轉(zhuǎn)90°棄去亞甲藍染液并用水沖洗干凈。干后油鏡讀片，讀片時從左向右觀察相鄰的視野，當(dāng)玻片移動至痰膜一端時，縱向向下轉(zhuǎn)換一個視野，然后從右向左觀察，依次類推。

1.2.4 結(jié)果判斷 分級報告標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施工作指南（2008年版）》［4］?？顾釛U菌陰性：連續(xù)觀察300個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌；報告抗酸桿菌菌數(shù)：1～8條抗酸桿菌／300視野；抗酸桿菌陽性（1＋）：3～9條抗酸桿菌／100視野；抗酸桿菌陽性（2＋）：1～9條抗酸桿菌／10視野；抗酸桿菌陽性（3＋）：1～9條抗酸桿菌／視野；抗酸桿菌陽性（4＋）：抗酸桿菌大于或等于10條／視野。

1.3 質(zhì)量控制

1.3.1 室內(nèi)質(zhì)控 新配制染色劑用泰安市結(jié)核病防治中心制備的已知結(jié)果的陽性和陰性質(zhì)控片進行檢測，質(zhì)控片制備和染色劑檢測方法見文獻［5］；報告陽性結(jié)果由3名實驗室工作人員同時確認，陰性結(jié)果由2名實驗室工作人員同時閱片確認。

1.3.2 室間質(zhì)控 應(yīng)用組、研究組均由泰安市結(jié)核病防治中心參比實驗室盲法抽取痰涂片進行復(fù)檢。應(yīng)用組抽樣方法：根據(jù)樣本量表確定抽取痰涂片50張，抽樣間距＝痰涂片總數(shù)780／抽片數(shù)50＝16，查隨機數(shù)字表確定第一張涂片序號為5，在應(yīng)用組780張?zhí)低科?，從?號起，每間隔16抽取1張涂片，直到抽滿50張。研究組抽樣方法：根據(jù)樣本量表確定抽取痰涂片80張，抽樣間距＝痰涂片總數(shù)1 089／抽片數(shù)80＝14，查隨機數(shù)字表確定第一張涂片序號為3，在研究組1 089張?zhí)低科?，從?號起，每間隔14抽取1張涂片，直到抽滿80張。

1.3.3 痰涂片質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn) 痰細胞數(shù)平均大于或等于10個／視野，痰膜大小10mm×20mm±5%，痰膜厚薄每視野平均2～3層，痰膜脫落小于或等于10%痰膜面積，染色背景著色，痰膜呈均勻亮藍色，無紅色斑塊。

1.3.4 陽性符合率和陰性符合率的計算公式 陽性符合率（%）＝原始結(jié)果陽性數(shù)／復(fù)檢結(jié)果陽性數(shù)×100；陰性符合率（%）＝原始結(jié)果陽性數(shù)／復(fù)檢結(jié)果陽性數(shù)×100。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 模型涂片法應(yīng)用組與研究組陽性檢出率、痰涂片制備和染色合格情況比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 痰標(biāo)本的性狀 應(yīng)用組在送檢的780份痰標(biāo)本中，干酪痰、膿痰、血痰、黏液痰等合格標(biāo)本724份，占92.82%，唾液、口水等不合格標(biāo)本56份，占7.18%。研究組在送檢的1 089份痰標(biāo)本中，干酪痰、膿痰、血痰、黏液痰等合格標(biāo)本1 036份，占95.13%，唾液、口水等不合格標(biāo)本53份，占4.87%。應(yīng)用組、研究組痰標(biāo)本性狀見表1。

表1 應(yīng)用組、研究組痰標(biāo)本性狀

2.2 應(yīng)用組、研究組模型涂片法制作的痰涂片鏡檢結(jié)果 模型涂片法制作的痰涂片應(yīng)用組陽性檢出率為29.74%（232／780），研究組陽性檢出率為31.68%（345／1 089），應(yīng)用組比研究組陽性檢出率低1.94%，無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0.799，P＝0.371），兩組陽性檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用組、研究組應(yīng)用模型涂片法制作的痰涂片鏡檢結(jié)果見表2。

表2 兩種痰涂片方法的鏡檢結(jié)果（n）

2.3 應(yīng)用組、研究組模型涂片法痰涂片制備和染色情況 應(yīng)用組與研究組應(yīng)用模型涂片法制作的痰涂片痰細胞、痰膜大小、厚薄、染色、痰膜脫落5項質(zhì)量指標(biāo)合格率均較高，兩組痰涂片5項質(zhì)量指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均大于0.05），差異無統(tǒng)計學(xué)意義。不同質(zhì)量指標(biāo)應(yīng)用組、研究組痰涂片制備和染色結(jié)果比較見表3。

2.4 室間質(zhì)控情況 泰安市結(jié)核病防治中心參比實驗室盲法抽取應(yīng)用組模型涂片法制作的痰涂片50張，復(fù)檢結(jié)果為定性、分級準(zhǔn)確，原始結(jié)果與復(fù)檢結(jié)果陽性符合率100.00%，陰性符合率100.00%，痰涂片質(zhì)量符合國家標(biāo)準(zhǔn)。同時盲法抽取研究組模型涂片法制作的痰涂片80張，復(fù)檢結(jié)果為定性、分級準(zhǔn)確，原始結(jié)果與復(fù)檢結(jié)果陽性符合率100.00%，陰性符合率100.00%，痰涂片質(zhì)量符合國家標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用組、研究組模型涂片法制作的痰涂片原始結(jié)果與復(fù)檢結(jié)果對照情況見表4。

表3 不同質(zhì)量指標(biāo)應(yīng)用組、研究組痰涂片制備和染色結(jié)果比較

表4 應(yīng)用組、研究組模型涂片法制作的痰涂片原始結(jié)果與復(fù)檢結(jié)果對照情況（n）

3 討 論

痰涂片檢測抗酸桿菌操作簡單，快速、價廉，特異性較高，是最普及、最經(jīng)濟的方法，也是中小實驗室和基層實驗室的主要檢驗方法。但是目前開展的目測涂片法制片質(zhì)量和陽性檢出率低，這已是不爭的事實，國內(nèi)也有諸多相關(guān)報道［6］。要提高痰涂片檢測抗酸桿菌的陽性檢出率，留取合格的痰標(biāo)本是前提，制作高質(zhì)量的痰涂片是提高陽性檢出率的關(guān)鍵［7］。從表1可以看出，應(yīng)用組、研究組分別留取了92.82%、95.13%的合格痰標(biāo)本，為提高陽性檢出率打下了良好基礎(chǔ)，在挑取痰標(biāo)本可疑部分0.05～0.1mL的前提下，涂片時涂抹過大，可導(dǎo)致痰膜過薄，痰細胞數(shù)量過少，鏡檢時觀察相同數(shù)量的視野，就會降低陽性檢出率，反之，涂抹過小，導(dǎo)致痰膜過厚，繼而引起染色不均，痰膜脫落，鏡檢模糊不清，也會降低陽性檢出率。如何提高制片質(zhì)量和陽性檢出率，成為痰涂片檢測抗酸桿菌亟待解決的問題，應(yīng)用組應(yīng)用劉慶福等研發(fā)的痰模型涂片法檢測抗酸桿菌結(jié)果顯示，模型涂片法可有效控制影響因素，提高制片質(zhì)量和陽性檢出率。

3.1 模型涂片法提高了陽性檢出率 從表2可以看出，應(yīng)用組、研究組模型涂片法陽性檢出率分別為29.74%、31.68%，均明顯高于國內(nèi)相關(guān)報道［8］。分析原因：一是為了評價模型涂片法檢測抗酸桿菌的應(yīng)用價值，挑選了初診的活動性肺結(jié)核患者，即臨床認為排菌可能性較大的肺結(jié)核患者為研究對象，這應(yīng)該是提高幅度過大的主要原因［9］。二是檢驗人員示范法指導(dǎo)患者留取了合格的痰標(biāo)本以及仔細挑取了可疑標(biāo)本涂片；三是模型涂片法提高了陽性檢出率。應(yīng)用組應(yīng)用結(jié)果顯示模型涂片法有效控制了痰涂片檢查抗酸桿菌的實驗程序，提高了制片質(zhì)量，從而提高了陽性檢出率。

3.2 模型涂片法實現(xiàn)了涂片標(biāo)準(zhǔn)化 模型涂片法是在挑取痰標(biāo)本一定量（0.05～0.1mL）的前提下，對照玻片下面的標(biāo)準(zhǔn)模（10mm×20mm）涂抹，控制了痰膜的面積，既然痰量、面積都已固定，也就控制了痰膜厚薄，與此同時，由于痰膜厚薄適宜，也就提高了染色效果，避免了痰膜脫落，提高了制片質(zhì)量。另外，可根據(jù)工作量大小制作數(shù)量不等的痰膜模型，在旋轉(zhuǎn)式抗酸桿菌涂片標(biāo)準(zhǔn)模型板上染色，通過染色板旋轉(zhuǎn)，實現(xiàn)了水洗同步，避免了痰片之間染色時間上的差異，大大提高了工作效率和染色效果［10］。

從表3可以看出，應(yīng)用組與研究組應(yīng)用模型涂片法制作的痰涂片痰細胞、痰膜大小、厚薄、染色、痰膜脫落5項質(zhì)量指標(biāo)合格率均基本一致，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明該方法重復(fù)性好，精密度高，減少了人為誤差，實現(xiàn)了涂片標(biāo)準(zhǔn)化。

3.3 模型涂片法制作的痰涂片符合國家標(biāo)準(zhǔn) 痰涂片室間質(zhì)控最重要的意義是保證檢驗質(zhì)量的準(zhǔn)確可靠。從表4可以看出，盲法抽取應(yīng)用組與研究組應(yīng)用模型涂片法制作的痰涂片，原始結(jié)果與復(fù)檢結(jié)果的陽性、陰性和痰涂片5項質(zhì)量指標(biāo)都具有很高的符合率，各項指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，說明模型涂片法的檢測結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。

總之，痰模型涂片法檢測抗酸桿菌，實現(xiàn)了涂片標(biāo)準(zhǔn)化，提高了制片質(zhì)量和陽性檢出率，靈敏度高，重復(fù)性好，實用性強，簡單易行，特別適合于基層實驗室應(yīng)用。

［1］ 劉慶福，劉予東，嚴(yán)秀麗.痰模型及目測涂片法檢測抗酸桿菌的比較研究［J］.中國防癆雜志，2012，34（6）：364-368.

［2］ 王隴德.結(jié)核病防治［M］.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2004.

［3］ 中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會.結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程［M］.北京：中國教育文化出版社，2006，30-37.

［4］ 衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局.中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施工作指南（2008年版）［M］.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2009，10-19.

［5］ 趙雁林，姜廣路，夏輝，等.結(jié)核菌痰涂片顯微鏡檢查標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)教材［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009.

［6］ 陳中秀，謝清波，周風(fēng)榮.聚集沉淀涂片與直接涂片抗酸染色法檢測抗酸桿菌的應(yīng)用比較［J］.中國防癆雜志，2009，31（4）：225-226.

［7］ 穆洮俊，司紅艷，李睛，等.甘肅省結(jié)核病痰涂片省對縣室間質(zhì)量控制結(jié)果分析［J］.中國防癆雜志，2009，31（8）：457-460.

［8］ 李國紅，苗潤青，賈艷輝，等.1 284份痰標(biāo)本分枝桿菌涂片鏡檢與培養(yǎng)結(jié)果分析［J］.中國防癆雜志，2011，33（8）：492-495.

［9］ 宋紅煥，孟爾旺，時金艷，等.痰標(biāo)本采集、儲存及運輸過程對培養(yǎng)結(jié)果影響的分析［J］.中國防癆雜志，2011，33（6）：372-376.

［10］劉慶福.模板涂片法檢測抗酸桿菌的臨床應(yīng)用價值［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2010，31（10）：1094-1098.